三种植物线粒体基因低温差异表达比较分析

王赛赛 李锦 祝建波

摘 要：線粒体作为植物细胞的能量代谢中心，在植物响应逆境胁迫中有重要的作用。该研究基于雪莲（Saussurea involucrata）、番茄（Lycopersicon esculentum）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）三种不同低温耐受性植物的低温转录组。通过blast比对和数据库检索筛选相关物种的线粒体基因，使用PlantCARE在线网站分析启动子，使用mega7软件对系统发育树构建分析。结果表明：通过差异表达基因筛选，分别在雪莲、拟南芥、番茄中筛选出2、24、15个显著差异表达基因，主要包括线粒体核糖体亚基和电子传递链各复合体亚基，其中部分基因的低温差异表达情况如NAD1和NAD5，可能与植物的低温适应性有关;通过表达模式的聚类分析，雪莲与拟南芥在基因的表达模式上相对于番茄更为相近，且不同类别的基因表达模式在不同物种间差异较大;雪莲与其他菊科植物的呼吸链相关基因的蛋白序列具有很大差异，与万年藓（Climacium dendroides）、牛舌藓（Anomodon minor）等高山植物的进化距离较近。在整体上拟南芥、番茄和雪莲三种植物线粒体基因在低温响应上具有很大差异，表明线粒体基因及其表达调控与植物的低温耐受性之间存在一定的关联性。

关键词：低温耐受性， 植物， 线粒体基因， 表达模式

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）08-1140-11

Abstract：As the energy metabolism center of plant cells， mitochondria play an important role in plant response to stress. To analyze difference in expression mode of mitochdria gene from the Arabidopsis thaliana， Lycopersicon esculentum and Saussurea involucrata， the differential expression genes （DEGs） was filtered in the three low temperature transcriptomes and comparison analysis was performed on the DEGs from three plants. All the mitochondria genes were filtered through blast against the mitochondria genomes that was downloaded from the NCBI database. Promoter analysis was performed through PlantCARE online website and the mega software was used to phylogenetic tree construction. The results were as follows：In total， there were 2， 24 and 15 DEGs were found in Saussurea involucrata， Arabidopsis thaliana and Lycopersicon esculentum， and these genes were mainly focused on mitochondrial ribosomal and electron transfer chain complex subunits; A few genes were seemed to relate to the cold adaptation that the expression level was positive to the ability of cold tolerance of the three plants， especially for the NAD1 and NAD5 gene; Through cluster analysis of expression patterns， Saussurea involucrata and Arabidopsis thaliana were more similar in genes expression mode than Lycopersicon esculentum， and the expression mode of different genes had a quite difference between different plants; Further analysis on the conserved motif sequence of these genes， the sequences of Saussurea involucrata showed more close relationship with the alpine plants such as Climacium dendroides and Anomodon minor than the other compositae plants. In general， the mitochondrial genes had a quite difference on the sequence of conserved motif and expression mode under the cold condition between the Arabidopsis thaliana， Lycopersicon esculentum and Saussurea involucrata. It was concluded that the mitochondria genes and its expressional regulation could be implicated in the cold adaptation of plants.

Key words：low temperature tolerance， plants， mitochondrial gene， expression mode

植物线粒体通过氧化磷酸化提供生命活动所需的各种能量，在光呼吸代谢、C4植物的光合作用和景天酸代谢（Picault et al.， 2004）等途徑中发挥着重要作用。线粒体的主要功能是进行三羧酸循环，通过电子传递链及氧化磷酸化合成ATP，这里是物质彻底氧化分解的场所，为细胞内的各种生命活动提供能量。此外，线粒体还与细胞内众多代谢过程相关，如参与细胞内信号转导，调节细胞内氧化还原电位，调控基因表达、细胞凋亡等（Millar et al.， 2011）。线粒体在植物响应逆境胁迫中有重要作用，在逆境胁迫下它们的形态结构和生理功能会发生明显的变化，在一定程度上可作为表征植物对逆境条件耐受性的依据（周宇飞等， 2013）。逆境胁迫会引起呼吸代谢的紊乱（Vanhoudt et al.， 2011; Tulah & Birch-Machin， 2013），造成活性氧的积累，过剩的ROS会诱导或加剧膜脂过氧化程度，导致脂质过氧化物水平迅速提高（Sairam & Srivastava， 2002），主要体现在线粒体膜和膜蛋白的损伤、线粒体蛋白质损伤、线粒体DNA损伤等（Rachel et al.， 2005; Foyer & Noctor， 2010; 马晓蕾等， 2013）。通过对冷胁迫下植物线粒体蛋白组的研究发现，一些线粒体蛋白如线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain， mETC）复合物I-V、交替氧化酶（alternative oxidase， AOX）、解偶联蛋白（uncoupling protein， UCP）等的表达水平受到冷或热胁迫的影响，预示着这些蛋白可能参与了植物对温度胁迫的响应过程（Yin et al.， 2009; Qin et al.， 2009; Tan et al.， 2012）。但是，植物线粒体中存在有多条电子传递途径，低温胁迫对不同植物线粒体呼吸链的具体伤害位点也会不同（刘美君等， 2014）。如在对半耐寒植物豌豆（Pisum sativum）的蛋白组研究中，低温对其电子传递链复合物的影响较小，主要影响的是线粒体中AOX和UCP的丰度（Taylor et al.， 2009）;在对耐寒植物高山离子芥（Chorispora bungeana）研究中，低温对其线粒体的影响又出现不同，其线粒体中AOX和UCP含量变化较小，但呼吸链复合体的变化较高（常建锋， 2007）。这表明不同植物线粒体在应对低温胁迫时的响应机制有所不同，其响应机制可能与其低温耐受性之间存在某种关联。

本研究主要根据雪莲、拟南芥和番茄三种不同低温耐受性植物的低温转录组，筛选并比较其线粒体基因表达差异，来探索植物线粒体低温表达模式与低温耐受性之间的关系。通过对低温条件下，三种不同低温耐受性植物线粒体基因表达差异比较和不同低温耐受性植物间线粒体基因进化关系的对比，来分析不同低温耐受性植物间低温响应机制和代谢水平的差异，以及通过响应冷胁迫的关键节点基因的序列差异，来探索不同低温耐受性植物间线粒体的低温表达模式的差别，为进一步研究植物线粒体冷胁迫响应机制和相关基因功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 雪莲、番茄、拟南芥线粒体低温差异表达基因的抽取

雪莲转录本源数据（李锦等， 2017）的下载，以向日葵、菊花等菊科线粒体基因参照，与转录本进行比对，参照雪莲转录组注释文件，筛选出雪莲线粒体基因的低温差异表达量数据，编写python脚本并筛选其基因序列。番茄低温转录本数据（Barrero-Gil et al.， 2016）的下载，以NCBI数据库中的番茄线粒体基因组为参考，从源数据中筛选出其线粒体基因的低温表达量数据。拟南芥低温转录组源数据（Vogel et al.， 2005）下载，以拟南芥线粒体基因组（Sloan et al.， 2018）为参考，筛选出拟南芥线粒体的低温差异表达量数据。

1.2 三种植物线粒体基因低温差异表达对比

根据三种植物的低温差异表达的线粒体基因表达量数据，使用R语言中的pheatmap包进行聚类分析，比较其低温线粒体基因表达差异，并分析差异表达基因分属的不同代谢通路，分析其代谢通路差异与低温胁迫之间的关系，主要从代谢通路的关键节点基因入手。

1.3 三种植物线粒体低温差异表达基因的验证

对以上筛选的部分线粒体低温差异表达基因进行实时荧光定量实验验证，检测其转录组数据的准确性。根据三种植物低温转录本的测定条件，分别对其进行低温处理，雪莲组培苗低温处理组为4 ℃冷驯化7 d，-2 ℃再处理48 h，参照组为4 ℃冷驯化7 d，所用雪莲为生长2个月的组培苗;拟南芥低温处理组条件为4 ℃处理24 h，参照组条件为18 ℃培养基中正常生长2周的拟南芥;番茄低温处理组条件为10 ℃处理48 h，参照组条件为25 ℃正常生长3周的番茄栽培苗。分别提取其RNA并反转录为cDNA，根据筛选出的三种植物主要的低温差异表达基因序列，设计实时荧光定量检测引物（各基因的引物序列与内参基因引物表1），进行RT-qPCR实验。分析三种植物的线粒体基因低温差异表达情况，是否与转录组中筛选的低温差异表达趋势一致。

1.4 三种植物的线粒体呼吸链基因的启动子分析

从筛选出的低温差异表达基因中，找到与呼吸链组成密切相关的基因，并获得其启动子序列（雪莲基因组由祝建波研究员提供，未发表），使用PlantCARE （Lescot et al.， 2002）在线网站分析其顺式作用原件，统计并分析呼吸链相关基因启动子中的顺式作用元件功能与数量。对含有低温响应元件的线粒体基因表达差异进行分析。

1.5 多种植物线粒体低温差异表达基因的进化关系分析

下载了17种拥有不同低温耐受性植物线粒体基因组序列，抗寒植物包括尖叶牛舌藓（Anomodon attenuates）、万年藓（Climacium americanum）、欧洲山杨（Populus tremula）、人参（Panax ginseng），耐寒植物有柴胡（Bupleurum falcatum）、蚕豆（Vicia faba）、沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus），较耐寒植物有甘蓝（Brassica oleracea）、菊花（Chrysanthemum boreale）、向日葵（Helianthus annuus），以及不耐寒的天仙子（Hyoscyamus niger）、烟草（Nicotiana attenuate）、丹参（Salvia miltiorrhiza）、巨桉（Eucalyptus grandis）、辣椒（Capsicum annuum）、葡萄藻（Botryococcus braunii）、共球藻（Trebouxiophyceae sp.）。通过对不同适应温度的植物线粒体基因蛋白保守序列的比对与进化关系分析，来探索和讨论不同植物间在低温胁迫下的线粒体基因的作用与响应机制。首先使用DNAMAN对线粒体基因中响应低温的蛋白序列进行多序列比对，并使用mega7分析它们之间的进化关系与距离。主要探究其低温耐受性与线粒体差异表达基因序列相似性的关系。

2 结果与分析

2.1 三种植物低温差异表达线粒体基因筛选

从三种植物的转录本中共筛选出32个线粒体差异表达基因， 雪莲2个， 番茄15个， 拟南芥24个。从表2可以看出，线粒体中低温差异表达基因主要为组成各呼吸链复合体的亚基和核糖体蛋白大小亚基基因，包括NAD、COB、COX、CCB、ATP6、RPS和RPL等。拟南芥低温差异表达基因有24个，主要包括呼吸链复合体I亚基基因8个，复合体Ⅲ亚基基因5个，复合物Ⅳ亚基基因2个，核糖体亚基基因8个，1个线粒体mRNA成熟酶R基因; 番茄低温差异表达基因有15个， 主要包括呼吸链复合体I亚基基因2个，复合体Ⅲ亚基基因1个，核糖体亚基基因13个;雪莲低温差异表达基因2个，均在呼吸链复合体上，其中复合体Ⅲ亚基1个，复合体Ⅳ亚基基因1个。其中，低温差异表达上调基因中拟南芥主要为电子传递链复合体亚基基因，番茄为核糖体亚基基因，雪莲无上调表达基因。其中，雪莲线粒体下调基因CCB206和COB下调幅度较大，在拟南芥和番茄中均上调的线粒体基因，上调幅度均是番茄大于拟南芥。

2.2 三种植物线粒体低温差异基因相对表达量分析

通过三种植物低温差异表达热图，雪莲与拟南芥相对于番茄在基因的表达模式上更为相近。在基因的表达聚类上，所有差异表达基因可分为6大类，从上到下分别为6类（图1）。其中第一类和第二类主要是线粒体核糖体亚基基因，低温差异表达模式大致相似，按雪莲、拟南芥到番茄依次递增。第一类中雪莲不变，拟南芥上调较小，番茄上调程度最大;第二类中除核糖体亚基外，还有两个呼吸链复合体亚基基因ATP6和CCB206，其低温差异表达与第一类相似，但拟南芥与番茄的低温差异表达程度差异不大，雪莲不变或显著下调，拟南芥和番茄均上调，且上调幅度一致。第五类也是由核糖体亚基基因组成，表达模式与第一类和第二类有一定的相似性，其低温差异表达模式番茄同样是显著上调表达，雪莲与拟南芥不变或下调幅度较小。第三类、第四类和第六类主要为呼吸链复合体亚基基因。第三类低温差异表达为雪莲和番茄差异较小或不变，拟南芥上调程度最大;第四类低温差异表达按番茄、雪莲、拟南芥依次递增，番茄差异表达下调程度大，雪莲不变，拟南芥差异表达上调或不变;第六类低温差异表达为雪莲和番茄不变，拟南芥下调幅度较小。其中第一类、第二类和第四类的部分核糖体亚基基因的差异表达情况与其低温耐受性呈负相关。三种植物线粒体在低温表达模式均有差异，整体上雪莲与拟南芥相较于番茄的低温表达模式更为相近，表明其耐受性与线粒体低温表达模式可能存在某种关联性。

2.3 三种植物的线粒体基因低温差异表达情况的验证

選取NAD1、NAD3、NAD5、RPS12、RPL2、RPL5、ATP6、COB、CCB206、COX1和COX2等11个线粒体基因进行低温表达差异检测，荧光定量PCR结果如表3所示，表中数据为根据各基因低温相对表达量（即2-ΔΔCT）的差异程度分为不同的等级。雪莲线粒体基因低温处理后的差异表达基因数比低温转录组中的较多，但大部分基因表达量与转录组数据一致。在转录组数据中没有筛选

出变化的基因，在荧光定量验证中出现了变化，但变化量不大，且重复实验中数据变化量不一致，使用数据较好的一组，求平均值进行计算，会存在一定的实验误差，当然也可能是由于转录组误差所致，但其表达量变化不显著，仍可以进行相关分析。但总体上三种植物的低温差异表达基因与转录组数据一致，少数基因的相对表达量大小可能有所出入，但表达量变化趋势没有变化。

2.4 三种植物的线粒体呼吸链基因的启动子分析

通过对三种低温差异表达基因的筛选，其中与呼吸链相关的基因主要有NAD1、NAD2、NAD4、NAD5、NAD6、NAD7、NAD9、ATP6、CCB382、CCB206、CCB256、CCB452、COB、COX1和COX2，分别分析其启动子， 启动子中的顺式作用元件种类主要有光响应元件、缺氧与厌氧诱导响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、生长素响应元件、脱落酸响应元件、水杨酸响应元件、防御与胁迫响应元件、低温响应元件、细胞周期调节响应元件，启动子和增强子区域中常见的响应元件CAAT-box、GC-motif，核心启动子元件TATA-box，参与昼夜控制元件circadian等具有不同功能的顺式作用原件。图2列出了呼吸链相关线粒体基因的元件类型与数量。

由表4可知，低温响应元件LTRE和脱落酸响应元件ABRE是基因低温诱导调控中的关键元件。在雪莲中显著下调的ATP6和CCB206基因的启动子中均包含1个ABRE和0个LTRE元件，说明该ABA响应元件可能与其他逆境诱导有关。拟南芥中低温显著上调的大多数基因均可发现其启动子中包含LTRE或ABRE，如NAD1、NAD5和NAD9等。但在拟南芥中NAD7作为显著低温上调基因，其基因启动子区域却均未发现LTRE和ABRE，说明该基因的低温诱导表达与其他诱导信号关联。番茄中的NAD1和NAD5基因类似与雪莲的ATP6和CCB206基因，均可发现ABRE元件的存在。整体上，大多低温上调表达的基因均可在其表达调控区域发现LTRE或ABRE，说明线粒体基因的表达受低温信号或相关激素信号的调控，但这种调控模式在不同植物间具有很大差异。

2.5 不同温度适应性植物线粒体基因序列分析与对比

通过NCBI根据不同适应温度，下载17种不同温度适应性植物线粒体编码蛋白序列，进行多序列分析，并构建系统发育进化树。由于植物线粒体基因组主要编码部分呼吸链复合体Ⅰ-Ⅵ亚基基因，这些复合体亚基基因不仅序列上高度保守，而且在数量上基本相同。所以各植物选择的线粒体编码基因序列主要是由NAD1、NAD3、NAD5、NAD7、NAD9、COB、CCB、COX1、RPS3、RPS5和RPL5等具有较高保守结构域的基因序列构成。由图3可知，雪莲与菊花和向日葵虽同属一科，但其序列相似度却不高，与其序列相似度较高的为拟南芥、牛舌藓、万年藓、甘蓝和欧洲山杨。与雪莲保守序列相似性较高的，除拟南芥与甘蓝外，其他均分布在寒温带针叶林，且都具有抗寒特性， 表明雪莲与其他植物的线粒体序列差异不仅体现在种属差异，还与其生长环境差异有关。高度保守的蛋白序列之间存在的差异，一定程度上与其所处环境压力有关。虽然雪莲、菊花、向日葵等同属菊科植物，但在进化关系上距离较远，与万年藓、牛舌藓、欧洲山杨等高山植物的进化距离较近，说明雪莲线粒体在高寒环境影响下，进化出自身適应该环境的机制，基因结构也与其他菊科植物产生较大差异。

3 讨论与结论

三种植物在低温下差异表达基因，主要集中在电子传递链各复合物亚基和核糖体蛋白亚基基因。由于植物的低温响应机制特别复杂，本文只针对呼吸链相关基因低温表达差异与低温耐受性之间的关系。通过对呼吸链相关基因分析发现，其中番茄和拟南芥中NADH脱氢酶亚基基因差异表达最多，即拟南芥与番茄冷胁迫的影响主要是依赖于NADH的呼吸受抑制程度较大，而依赖于琥珀酸的呼吸受抑制较轻，冷胁迫主要破坏呼吸链中复合体Ⅰ的活性，复合体Ⅰ低温下差异表达情况，对其低温耐受性有重要作用（Daniela et al.， 2007）。拟南芥与番茄在调节依赖于NADH的电子传递途径时的差异，如NAD1、NAD5拟南芥中显著上调，而番茄显著下调，反映出拟南芥与番茄在冷胁迫上的耐受性差异。两种植物的电子传递链复合体Ⅲ、IV亚基基因在冷胁迫下也具有不同的表达模式，该复合体同样在植物低温胁迫下具有重要作用，其表达上调有助于呼吸电子链的电子传递，有助于氧自由基的消耗，减少活性氧对细胞的损伤（Verrier et al.， 2008; Rayapuram et al.， 2008; Gaudet et al.， 2011）。拟南芥和番茄该复合体亚基基因的低温差异表达模式同样有区别，拟南芥中该复合体亚基基因大多显著上调表达，番茄中下调表达或不变，如CCB、COX等基因在两种植物中的低温表达差异，这种表达差别同样是其低温耐受性差异的原因。雪莲的呼吸链相关基因的差异表达模式不同于其他两种植物，由于其较强的低温耐受性，复合体Ⅰ-Ⅳ的大部分亚基基因均未受到低温伤害，只有复合体Ⅳ、Ⅴ中的CCB和ATP6出现显著下调，冷胁迫主要影响的是其电子传递链的最后部分，通过控制能量代谢速率降低机体能量消耗和呼吸效率，来应对低温胁迫（Jacoby et al.， 2011）。三种植物在低温胁迫下表达模式和调控机制的差异，可能是形成其低温耐受性差异的一个原因。通过对呼吸链相关基因蛋白序列分析得出，虽然雪莲、菊花、向日葵等同属菊科植物，但在进化关系上距离较远，与万年藓、牛舌藓、欧洲山杨等高山植物的进化距离较近，雪莲与其他植物的线粒体序列差异不仅体现在种属差异，还与其生长环境差异有关。

通过以上对三种植物的线粒体差异表达基因模式和基因表达聚类分析得出，雪莲与拟南芥相对于番茄在基因的表达模式上更为相近;不同冷耐受性植物线粒体之间的线粒体保守序列分析得出，虽然雪莲和菊花、向日葵等同属菊科植物，但在进化关系上距离较远，却与万年藓、牛舌藓和欧洲山杨等高山植物的进化距离较近，这一现象同样验证了一部分线粒体基因的低温差异表达与其自身冷耐受性相关联这一结论。

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（责任编辑 何永艳）