金莲花不同溶剂提取物抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的谱-效关系研究

2020-10-20南敏伦孙琦杨振司学玲马春霞白雪赫玉芳

中国药房 2020年18期

南敏伦孙琦杨振司学玲马春霞白雪赫玉芳

摘要目的：研究金蓮花11种不同溶剂提取物抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的谱-效关系。方法：利用高效液相色谱-串联质谱法建立金莲花11种不同溶剂提取物的指纹图谱，通过与对照品、文献信息比对，指认共有峰对应的化合物。采用MTT法检测金莲花11种不同溶剂提取物对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9c2存活率的影响，采用酶联免疫吸附测定法检测细胞中丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平和上清液中乳酸脱氢酶（LDH）含量。通过灰色关联度分析法（GRA）和偏最小二乘法（PLS）联合分析共有峰对应成分与抗心肌细胞缺氧/复氧损伤（药效）的谱-效关系。结果：金莲花11种不同溶剂提取物的指纹图谱中有22个共有峰，指认出22个化合物。与缺氧/复氧损伤组比较，缺氧/复氧+S1～S6、S9、S10组细胞的存活率均显著升高，MDA含量、ROS水平、LDH含量均显著降低（P<0.05）;缺氧/复氧+S8组细胞的ROS水平、LDH含量均显著降低（P<0.05）。22个化合物与药效的GRA关联度均大于0.8;除峰1、2、7、13、14、21外，其余峰对应化合物与药效的PLS分析回归系数均大于0（即成正相关）;贡献排名前9位的共有峰均为峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。结论：荭草苷（峰6）、牡荆苷（峰11）、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、荭草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荆素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金丝桃苷（峰12）、牡荆素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-荭草苷（峰15）可能是金莲花抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的主要成分。

关键词金莲花;心肌细胞H9c2;缺氧/复氧损伤;谱-效关系;灰色关联度分析法;偏最小二乘法

中图分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）18-2219-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.08

ABSTRACT OBJECTIVE： To study spectrum-effect relationship of 11 different solvent extracts from Trollius chinensis against hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte. METHODS： HPLC-MS/MS method was used to establish the fingerprints of 11 different solvent extracts from T. chinensis， the compounds corresponding to the common peaks were identified by comparing with the substance control and literature information. MTT assay was used to detect the effects of 11 different solvent extracts from T. chinensis on the survival rate of rat myocardial H9c2 cells injured by hypoxia/reoxygenation. The MDA content， ROS level in cells and LDH content in the supernatant were detected by ELISA. GRA and PLS method were used to analyze the spectrum-effect relationship between the compounds corresponding to common peak and anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocyte （drug effect）. RESULTS： There were 22 common peaks in 11 different solvent extracts from T. chinensis， and 22 compounds were identified. Compared with hypoxia/reoxygenation injury group， survival rate of hypoxia/reoxygenation injury+S1-S6，S9 and S10 groups were increased significantly， while MDA content， ROS level and LDH content were decreased significantly （P<0.05）; ROS level and LDH content of hypoxia/reoxygenation injury+S8 group were decreased significantly （P<0.05）. The r of GRA analysis of 22 compounds with drug effects were all higher than 0.8. Except for peaks 1， 2， 7， 13， 14 and 21， r of PLS analysis of rest peaks with drug effects were higher than 0（being positive correlation）. Top 9 common peaks in the list of contribution rate were peak 6>11>4>5>8>9>12>10>15. CONCLUSIONS： Orientin （peak 6），vitexin （peak 11）， orientin-2″-O-β-L-galacto- pyranosl （peak 4）， orientin-2″-O-β-D-Pyrine xylosides （peak 5）， quercetin-3-O-glucopyranoside （peak 8）， vitexin-2″-O-β-L-galactoside （peak 9）， hyperoside （peak 12）， vitexin-2″-O-β-D-pyrine xylosides （peak 10）， 2″-O-（2[″][′]- methylbutyry-loxy）-orientin （peak 15） may be the main components of anti-hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocytes.

2.1.6 稳定性试验取“2.1.3”项下供试品溶液（编号：S3）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.1”“2.1.2”项下色谱与质谱条件进样测定，以荭草苷峰（峰6）为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.22%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.33%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验取金莲花药材粉末100 mg，共6份，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液（编号：S3），再按“2.1.1”“2.1.2”项下色谱与质谱条件进样测定，以荭草苷峰（峰6）为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.38%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.02%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.8 指纹图谱生成及特征峰确认按“2.1.3”项下方法制备金莲花11种提取物的供试品溶液，再按“2.1.1”“2.1.2”项下色谱与质谱条件进样测定，记录色谱图。将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，设置时间窗宽度为0.1 min，图谱间距为20 mV，通过多点校正及自动匹配生成金莲花11种提取物的叠加指纹图谱，结果见图1。由于S3图谱吸收信号较强、峰形明显、稳定性较好，故选择S3样品的图谱作为参照图谱。依据各色谱峰的准分子离子峰及二级质谱碎片信息，通过与对照品、文献信息[3，7-13]比对，指认金莲花中共有峰对应的化学成分。结果，金莲花11种提取物指纹图谱中有共有峰22个，化学成分的指认结果见表1。

2.2 金莲花提取物对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

2.2.1 细胞培养将H9c2细胞放置在培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养，每2 d更换1次培养基，待细胞生长至80%～90%时进行传代，并取对数生长期的细胞进行后续试验。

2.2.2 分组与处理将对数生长期的H9c2细胞分为13组，分别为正常对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+各提取物（S1～S11）组。正常对照组细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2条件下培养3 h;缺氧/复氧组细胞用无糖、无血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2、95%N2條件下培养3 h后，再按正常对照组条件培养3 h;缺氧/复氧+各提取物组细胞先分别用0.1 ?g/L（按预试验结果设置，以提取物质量计）的S1～S11预处理30 min后，再按照缺氧/复氧组条件培养。

2.2.3 H9c2细胞存活率检测采用MTT法检测。将H9c2细胞按5×103个/孔接种于96孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，按“2.2.2”项下方法分组、处理后，分别加入MTT试剂100 μL，于37 ℃条件下继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO 100 μL，振荡反应10 min，用酶标仪于490 nm波长处检测各孔光密度（OD）值，以不含细胞的空白培养基作为空白组，计算细胞存活率：细胞存活率=（试验组OD值/空白组OD值）×100%。每组设6个复孔，试验重复3次。

2.2.4 H9c2细胞中MDA含量、ROS水平和上清液中LDH含量检测采用ELISA法检测。将H9c2细胞按5×103个/孔接种于96孔板中，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，按“2.2.2”项下方法分组、处理后，按试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪于450 nm波长处检测各孔OD值，计算细胞中MDA含量和ROS水平以及上清液中LDH含量。试验重复3次。

2.2.5 数据处理及结果分析使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。各组细胞的存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的检测结果见表2。

由表2可见，与正常对照组比较，缺氧/复氧组细胞的存活率显著降低，MDA含量、ROS水平、LDH含量均显著升高（P<0.05）;与缺氧/复氧组比较，除缺氧/复氧+S7组、缺氧/复氧+S8组、缺氧/复氧+S11组外其余各组细胞的存活率均显著升高，MDA含量均显著降低（P<0.05）;除缺氧/复氧+S7组、缺氧/复氧+S11组外其余各组细胞的ROS水平、LDH含量均显著降低（P<0.05）。

2.3 金莲花化学成分与抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的谱-效分析

2.3.1 GRA 利用DPS-3.01软件，根据细胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量计算金莲花抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的综合活性数据，加权系数均为0.25。将共有峰峰面积数据与综合活性数据进行关联，通过对原始数据进行标准化转化处理后，计算关联度并排序，以评估各共有峰对药效的贡献，结果见表3。由表3可见，22个共有峰所对应的化学成分与药效的关联度均大于0.8，贡献排名前9位的共有峰依次为峰6>11>4>5>8>9>12>10>15。

2.3.2 PLS分析利用SIMCA-11软件，经过多次提取主成分、多次迭代后，拟合出22个共有峰所对应的化学成分对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的重要程度（即标准化回归系数）并排序，结果见表4。

3 讨论

据文献报道，谱-效关系的统计学分析有多种方法，如相关分析法、GRA法、聚类分析法及PLS法[5]。本文应用了GRA法和PLS法联合分析了金银花11种不同溶剂提取物中22个共有峰对应成分与抗心肌细胞缺氧/复氧损伤（药效）的谱-效关系。GRA法主要分析两种因素在发展过程中的关联度大小，但其只能单独考察各成分的重要性，并不能反映各成分对药效的综合作用[6-7]，故本文又采用了PLS法，通过拟合药效与色谱峰之间的相关性，分析各成分对药效的重要程度[14-15]。

据文献报道，金莲花中主要成分是黄酮类成分，此外还有少量的挥发油、生物碱、有机酸、多糖、醇类、苷类等多种成分[9]。由于化学成分的多样性，提取方法也较多，常用的提取方法有微波提取法、回流提取法、超声提取法和超临界流体提取法等[16-17]，回流提取能盡可能得提取有效成分[13]，故本研究选择了回流提取法。此外，不同溶剂对不同类化学成分的溶解性不同，如挥发油易溶解于石油醚中，生物碱、醇类易溶解于三氯甲烷中，黄酮易溶解于高浓度乙醇或乙酸乙酯中，黄酮苷易溶解于低浓度乙醇或正丁醇中，多糖易溶解于水中，故为了尽可能地将各类成分均提取出来，本文选择了“2.1.3”项下的提取方法，并得到了11种提取物。

本研究初步评价了金莲花90%、80%、70%、60%、50%乙醇提取物以及石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水萃提取物对心肌细胞缺氧/复氧损伤的主要指标细胞存活率、MDA含量、ROS水平、LDH含量的影响。研究结果表明，其中不同体积分数乙醇提取物以及乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物对各指标的影响较为显著。

本研究分析鉴定了金莲花11种提取物中22个化学成分，通过谱-效分析确定了其中对心肌细胞缺氧/复氧损伤起保护作用的主要化学成分可能为峰6、11、4、5、8、9、12、10、15，即荭草苷、牡荆苷、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、荭草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷、牡荆素-2″-O-β-L-半乳糖苷、金丝桃苷、牡荆素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-荭草苷，主要为黄酮类化合物，提示金莲花的抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用可能与上述成分相关。有文献报道，荭草苷、牡荆苷等黄酮类成分为金莲花的主要活性成分[12]，且上述成分均有一定的抗心肌缺血作用[4]，进一步论证了本研究的可靠性。这对于阐明金莲花抗心肌缺血的药效物质基础研究、金莲花及其提取物多指标质量控制标准的建立具有积极意义。

综上所述，荭草苷（峰6）、牡荆苷（峰11）、荭草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰4）、荭草素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰5）、槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（峰8）、牡荆素-2″-O-β-L-半乳糖苷（峰9）、金丝桃苷（峰12）、牡荆素-2″-O-β-D-吡喃木糖苷（峰10）、2″-O-（2[″][′]-甲基丁酰基）-荭草苷（峰15）可能是金莲花抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的主要成分。

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