P38有丝分裂原活化蛋白激酶在烟雾暴露大鼠肺血管重塑中的作用

马海丽 彭红星 曾玉兰 江雅婷 周月泉

肺血管重塑在慢性阻塞性肺疾病和肺源性心脏病过程中起关键作用，吸烟、炎症、低氧等均可诱导肺血管重塑[1]，其中长期烟雾暴露可引起肺血管平滑肌细胞的异常增殖，促使肺肌型动脉增加、肺小动脉结构改变[2]，是引起肺血管重塑的一项独立危险因素。有研究表明，烟雾暴露可促使P38有丝分裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的活化增加，激活一系列炎症和细胞因子，在慢性阻塞性肺疾病的气道炎症及气道重塑病理过程中发挥重要作用。本研究通过制备烟雾暴露大鼠模型，观察不同时间段P38MAPK的表达水平及肺血管重塑情况，以及加入P38MAPK抑制剂后P38MAPK表达水平及肺血管重塑的变化，探讨P38MAPK信号通路与烟雾暴露大鼠肺血管重塑的关系。

材料与方法

1.材料：SD雄性大鼠50只，体质量为200～220 g，饲养于华中科技大学同济医学院动物中心。兔抗P38MAPK多克隆抗体购于爱必信(上海)生物科技有限公司，P38MAPK特异性抑制剂SB203580(美国Selleck公司)、小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)单克隆抗体、DAB显色试剂盒均购于武汉谷歌生物公司，Mix试剂盒和逆转录试剂盒购于康为世纪公司，P38MAPK、GAPDH引物由天一辉远公司合成。

2.方法

(1)动物模型制备及分组：制备烟熏箱(110 cm×75 cm×50 cm)，每5支香烟捆扎点燃后放入烟熏箱，将大鼠分别装入小钢丝笼中，置于烟熏箱内被迫吸入烟雾，使用CY-12C数字测氧仪监测烟熏箱中的氧浓度，使烟熏箱中的氧浓度保持在20%～21%[3]。将SD大鼠随机分为5组：对照组(C组)、烟雾暴露4周组(S4组)、烟雾暴露12周组(S12组)、SB203580干预4周组(SB4组)、SB203580干预12周组(SB12组)，每组各10只。C组大鼠在常规无烟环境中喂养；烟雾暴露各组大鼠放入烟熏箱中，每天烟雾暴露2次，2次暴露时间间隔>4 h；SB203580干预各组：前期制备同烟雾暴露组，每次吸烟前予每只大鼠腹腔注射5 mg/kg SB203580。SB203580以二甲基亚砜(DMSO)溶解，使用前以生理盐水稀释，使DMSO的终浓度为2%，SB203580的最终浓度为5 mg/ml。C组大鼠分别于第4、12周各处死5只，S4组和SB4组大鼠均于第4周处死，S12组和SB12组大鼠均于第12周处死。

(2)病理标本制作：各组造模完成后麻醉后处死大鼠，分离肺脏和右肺动脉，右肺动脉置于-80 ℃冰箱保存供逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)用。左肺放入4%的中性甲醛固定，脱水、石蜡包埋，用于苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化。

(3)肺组织HE染色和病理形态观察：石蜡包埋切片后对肺组织进行HE染色，观察各组大鼠肺组织及肺血管的病理学改变。每张切片随机选取结构完整、断面直径为50～200 μm的肺动脉5支，采用HMIAS-2000彩色图文分析系统进行测量分析，测量血管的内外径，计算血管壁厚度、血管壁面积、血管总面积及血管重塑指标[血管壁面积/血管总面积(WA)及血管壁厚度/血管外径(WT)]。

(4)免疫组化法检测肺动脉α-SMA和肺动脉P38MAPK蛋白的表达水平：石蜡切片脱蜡水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，每次5 min，3%过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗2次，每次5 min，枸橼酸钠缓冲液抗原修复后，滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，分别加入小鼠抗α-SMA单克隆抗体和兔抗P38MAPK多克隆抗体，4 ℃过夜，加入DAB试剂盒显色，脱水、透明、封片后，在显微镜下随机选取每张切片上肺动脉采集图像，采用HMIAS-2000图文分析系统进行定量分析。

(5)RT-PCR检测肺动脉P38MAPK mRNA的表达水平：将保存于-80 ℃冰箱中的肺动脉组织加入TRIzon试剂，按照试剂盒说明书提取肺动脉总RNA，取3 μg RNA进行逆转录合成cDNA,然后取1 μl cDNA进行PCR扩增，设计特异性引物，反应在25 μl体系中进行,反应条件为95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。由BioRad软件分析计算各组Ct值，以2-△△ct表示P38MAPK mRNA表达水平。PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

结 果

1.5组大鼠肺动脉HE染色结果比较：C组大鼠肺动脉管壁较薄、光滑，平滑肌细胞排列规则，可见少量炎症细胞；烟雾暴露组大鼠肺动脉管壁可见不同程度增生，管壁周围较多炎症细胞浸润，随着暴露时间逐渐延长，管壁增生逐渐明显；与烟雾暴露各组比较，P38MAPK抑制剂干预各组大鼠肺动脉管壁增生减弱，炎症细胞浸润明显减少。见图1。S4组、S12组大鼠肺动脉WA和WT均高于C组，S12组大鼠肺动脉WA和WT均高于S4组，SB4组大鼠肺动脉WA和WT均低于S4组，SB12组大鼠肺动脉WA和WT均低于S12组(P<0.05)。见表2。

图1 5组大鼠肺动脉HE染色结果比较(A：C组；B：S4组；C：S12组；D：SB4组；E：SB12组；HE染色，×400)

图2 5组大鼠肺动脉α-SMA的表达水平比较(A：C组；B：S4组；C：S12组；D：SB4组；E：SB12组；免疫组化染色，×200)

图3 5组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白的表达水平比较(A：C组；B：S4组；C：S12组；D：SB4组；E：SB12组；免疫组化染色，×200)

表2 5组大鼠肺血管重塑指标比较

2.5组大鼠肺动脉α-SMA的表达水平比较：C组、S4组、S12组、SB4组、SB12组大鼠肺动脉α-SMA的表达水平分别为0.10±0.01、0.16±0.01、0.29±0.02、0.09±0.01及0.17±0.02，其中S4组和S12组高于C组，S12组高于S4组，SB4组低于S4组，SB12组低于S12组(P<0.05)。见图2。

3.5组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达水平比较：胞质呈棕黄色染色为P38MAPK蛋白阳性表达。S4组、S12组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达水平均高于C组，S12组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达水平均高于S4组，SB4组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达水平均低于S4组，SB12组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达水平均低于S12组(P<0.05)。见图3和表3。

表3 5组大鼠肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA表达水平比较

讨 论

研究发现，香烟烟雾可直接作用于肺血管系统，进而引起一系列病理生理改变。香烟烟雾提取物可引起COPD患者早期肺血管改变，甚至在无气流受限的吸烟者中即已出现肺血管改变，与非吸烟者比较，吸烟者的肺血管厚度明显增加[4]。本研究通过建立烟雾暴露大鼠模型，发现其存在不同程度的肺泡结构破环，肺血管的管壁增厚，管腔变窄，肺动脉WA和WT高于C组，随着烟雾暴露时间的延长，WA和WT均逐渐增加，肺动脉壁逐渐增厚，周围炎症细胞浸润逐渐明显，S12组大鼠的肺动脉管壁增厚、管腔狭窄最明显。α-SMA主要表达于肺平滑肌细胞和成纤维细胞中，可间接反映肺血管重塑及肺小动脉肌化[5]。本研究结果显示，烟雾暴露各组大鼠肺动脉α-SMA的表达水平均高于C组，且与烟雾暴露时间呈正比，表明香烟烟雾可直接引起肺血管重塑，肺血管重塑的程度随着暴露时间延长逐渐增加。

烟雾暴露可通过激活多种炎症因子参与肺血管重塑过程[6]。P38MAPK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)介导细胞反应通路的重要分支，P38MAPK活化后作用于下游的激酶、细胞因子等，产生多种效应，在体内作用广泛[7]。烟雾暴露可激活中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎症细胞，促进多种细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2、基质金属蛋白酶(MMP)-12等，活化P38MAPK,上调P38MAPK的表达[8]。本研究结果显示，P38MAPK蛋白在C组大鼠肺动脉中存在少量表达，而烟雾暴露刺激后P38MAPK蛋白的表达明显增加，且随着时间的延长，P38MAPK蛋白的表达水平逐渐增加。此外，与C组比较，烟雾暴露各组大鼠P38MAPK mRNA的表达水平上调，且P38MAPK mRNA的表达与暴露时间呈正比，推测P38MAPK可能参与了烟雾暴露引起的肺血管重塑过程。既往研究结果显示，肺血管重塑可能与肺动脉平滑肌细胞的增殖分化有关，MAPK信号通路可能参与肺平滑肌细胞的增殖和凋亡的调控，进而引起肺血管重塑[9]。程振玲[10]在低氧引起肺动脉高压模型中也发现了P38MAPK的表达增加。有研究结果发现，相对于非肺动脉高压，肺动脉高压患者中活化P38MAPK的表达水平明显升高，P38MAPK信号通路激活可引起肺血管平滑肌细胞异常增殖，最终导致肺动脉高压[11]。

SB203580作为P38MAPK抑制剂的一种，可抑制P38MAPK信号通路介导的细胞反应。有研究结果发现，P38MAPK抑制剂可逆转低氧引起的肺血管重塑，通过抑制P38MAPK信号通路，减轻炎症因子释放，进而逆转肺动脉高压[12-13]，抑制肺动脉收缩[14]。本研究结果显示，与烟雾暴露组比较，加入P38MAPK抑制剂后，大鼠肺动脉管壁变薄，管壁增生减弱，炎症细胞浸润减轻，肺血管重塑指标WA和WT及α-SMA的表达水平均降低，提示肺小动脉肌化程度下降。同时，肺动脉P38MAPK蛋白和mRNA的表达明显受到抑制，表明通过抑制P38MAPK下调P38MAPK的表达，可减缓肺血管重塑的程度，提示P38MAPK可能是引起肺血管异常增生的重要因子之一。但本研究未进一步探讨该通路下游因子的表达，尚存在一定的不足。

综上所述，烟雾暴露可能通过上调P38MAPK的表达引起肺血管平滑肌增生，进而引起肺血管重塑，P38MAPK抑制剂可降低P38MAPK的表达，减轻肺血管重塑，提示P38MAPK可能参与了吸烟引起的肺血管重塑。但对于P38MAPK信号通路及其P38MAPK抑制剂的作用机制尚需进一步研究。