LncRNANeat1在肝细胞癌组织和细胞株中的表达及临床意义

李芳芳 葛星星 朱坚胜

肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均较高[1]。早期诊断、早期治疗、术后随访复查是提高肝细胞癌患者5年生存率的重要手段；然而，目前仍缺乏灵敏、可靠的分子生物学标志物。长链非编码RNA（LncRNA）被定义为长度＞200个核苷酸的非蛋白质编码RNA转录物[2]。越来越多研究表明，LncRNA与多种肿瘤有关，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝细胞癌等[3]。LncRNA Neat1是由11号染色体上1个被称为家族性肿瘤综合征多发性内分泌肿瘤1型的基因位点转录而来，是编码 Neat1_v1（3.7kb）和 Neat1_v2（23kb）两种变体的LncRNA[4]。目前已在很多恶性肿瘤中发现LncRNANeat1表达异常，包括神经胶质瘤[5]、人喉鳞状细胞癌[6]、乳腺癌[7]、胃癌[8]、食管癌[9]等。这些研究认为，LncRNA Neat1异常表达是肿瘤发生、发展的关键调节因子，可作为治疗干预的潜在靶标。本研究检测肝细胞癌患者癌组织及其癌旁正常组织以及肝癌细胞株、正常人肝细胞株中LncRNA Neat1的表达，分析肝细胞癌患者癌组织LncRNA Neat1表达与临床特征的关系，同时探讨LncRNA Neat1表达对肝细胞癌的诊断价值，以期为临床诊治提供参考，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年1月至2017年12月在浙江省台州医院肝胆外科接受手术的16例肝细胞癌患者为研究对象，其中男14例，女2例；年龄36～73（58.81±9.50）岁。纳入标准：（1）术后病理检查证实为肝细胞癌；（2）术前未接受过其他抗癌治疗；（3）临床资料完整。收集所有患者癌组织及癌旁正常肝组织（距肿瘤2 cm以上）标本。本研究经医院伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。

1.2 细胞株培养 正常人肝细胞（LO2）、人高转移肝癌细胞（MHCC97-H）、人低转移肝癌细胞（MHCC97-L）均购自上海酶研生物有限公司。使用含10% FBS及双抗（100 U/ml青霉素+100 mg/L链霉素）的高糖DMEM培养基，在37℃、5% CO2的培养箱中进行常规培养。

1.3 资料收集 收集患者性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平等资料。

1.4 癌组织、癌旁正常组织及细胞株中LncRNA Neat1相对表达量检测 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取LO2、MHCC97-H、MHCC97-L细胞株以及16例肝细胞癌患者癌组织及其癌旁正常组织的总RNA，采用核酸分析仪检测所提取RNA的浓度和纯度，取适宜纯度（1.8～2.0）的RNA进行逆转录反应。将RNA逆转为CDNA，并以其为模板进行qRT-PCR，反应体系20 μl（包括上下游特异性 PCR 引物各 0.3 μl、cDNA 模板 1 μl、灭菌超纯水 8.4 μl、SYBR Green I qPCR Master Mix 10 μl；反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，共40个循环。Neat1的引物根据美国生物技术信息中心已发表的LncRNA Neat1序列设计，并由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算 LncRNA Neat1 相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；两组比较采用配对样本t检验。计数资料组间比较采用Fisher确切概率法。血清ALT、AST、TBil水平与癌组织LncRNA Neat1相对表达量的相关性分析采用Spearman秩相关。绘制ROC曲线分析LncRNA Neat1相对表达量诊断肝细胞癌的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织与癌旁正常组织中LncRNA Neat1相对表达量比较 肝细胞癌组织LncRNA Neat1相对表达量为0.46±0.38，明显低于癌旁正常组织的1.41±1.05，差异有统计学意义（t=4.435，P＜0.05）。

2.2 患者临床特征与癌组织中LncRNA Neat1相对表达量的关系 不同肿瘤分化程度患者癌组织LncRNA Neat1相对表达量比较，差异有统计学意义（均P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤部位、甲胎蛋白水平患者LncRNA Neat1相对表达量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。患者血清 ALT、AST、TBil水平与癌组织LncRNA Neat1相对表达量均未见相关（rs=-0.251、-0.134、-0.296，均 P ＞0.05）。

表2 不同临床特征患者癌组织LncRNA Neat1相对表达量比较

2.3 LncRNA Neat1相对表达量诊断肝细胞癌的效能LncRNA Neat1相对表达量诊断肝细胞癌的AUC、约登指数、灵敏度、特异度分别为 0.793、0.500、0.875、0.625，见图1。

图1 LncRNA Neat1相对表达量诊断肝细胞癌的ROC曲线（LncRNA为长链非编码RNA）

2.4 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2 细 胞 株 LncRNA Neat相对表达量比较 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2细胞株LncRNA Neat1相对表达量分别为0.24±0.20、0.39±0.08、1.01±0.20，差异有统计学意义（F=18.181，P＜0.05）；与 LO2 细胞株比较，MHCC97-L、MHCC97-H 细胞株相对表达量明显降低（均P＜0.05）；MHCC97-L与MHCC97-H细胞株相对表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

3 讨论

有研究表明，肝细胞癌的诊断时间对疾病进展、早期治疗的有效性、5年生存率等起着决定性作用[10]。甲胎蛋白是目前临床上最常用的筛选和诊断肝细胞癌的血清诊断标志物之一，但在急慢性肝炎、肝硬化、妊娠期妇女等人群中也可出现不同程度的升高；此外，有20%～30%的肝细胞癌患者血清甲胎蛋白表达为低水平（阴性结果）。

由于LncRNA在生物体液中较为稳定，已成为癌症的诊断生物标志物之一[11]。有研究表明LncRNA在肿瘤发生的多个病理过程中起作用，包括细胞增殖、细胞信号传导、血管生成等[12]。已有多项证据表明LncRNA可以通过调节肝癌干细胞的自我更新能力和其他生物学功能来影响肝细胞癌的发生、发展[13-16]。LncRNA Neat1是几种癌症发生、发展的关键调节因子，但目前对其在恶性肿瘤中的作用尚不十分明确。Gibb等[17]汇编了272个基因表达的人类系列分析文库并开发了新的LncRNA发现渠道，结果发现LncRNA Neat1在肝细胞癌组织中的表达水平低于正常组织。但Guo等[18]报道Neat1在肝细胞癌组织中高表达，且与肝细胞癌患者临床特征密切相关，包括肿瘤数量、大小、转移以及TNM分期、门静脉肿瘤栓子状态、血管侵袭、肿瘤细胞浸润等。而Xiong等[19]基于57个微阵列和RNA-seq数据集得出的结果证实LncRNA Neat1在肝细胞癌组织中的表达是下调的。

本研究采用qRT-PCR法检测16例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁正常组织以及肝癌细胞、正常人肝细胞中LncRNA Neat1的表达差异，结果显示肝细胞癌组织、肝癌细胞中的表达分别低于癌旁正常组织、正常人肝细胞，且差异具有统计学意义。笔者进一步分析肝细胞癌患者LncRNA Neat1表达水平与临床特征的关系，结果发现LncRNA Neat1表达水平与肿瘤分化程度有关，与其他临床特征（如年龄、性别、肿瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平）等均无关。可见，甲胎蛋白阴性的肝细胞癌患者也可能出现LncRNA Neat1表达异常。提示LncRNA Neat1检测早期肝细胞癌较甲胎蛋白更灵敏。笔者认为临床上采用甲胎蛋白联合LncRNA Neat1检测将提高肝细胞癌的早期诊断率。本研究还通过绘制ROC曲线分析了LncRNA Neat1的诊断效能，发现AUC、约登指数、灵敏度、特异度分别为0.793、0.500、0.875、0.625，提示 LncRNA Neat1 有望成为诊断肝细胞癌的一种新型肿瘤标志物。然而，本研究与Guo等[17]得出的结果并不一致，笔者认为存在实验差异的原因，一方面可能是样本来源、总RNA提取方法、LncRNA Neat1表达检测方法不同所致；另一方面，LncRNA Neat1 有 2 种变体：Neat1_v1 和 Neat1_v2[4]，尽管这2种变体共享相同的转录起始位点，但两者3′末端加工机制是不同的，这2种转录物在肿瘤中可能起不同的作用[20]。Wu等[21]检测了结直肠癌患者全血、癌组织和癌旁组织中Neat1_v1和Neat1_v2的表达水平，发现Neat1_v1和Neat1_v2在结直肠癌患者全血中均高表达，但肿瘤组织、正常组织中Neat1_v1与Neat1_v2表达差异无统计学意义，同时证明Neat1_v1可以促进肿瘤细胞的生长和侵袭，而Neat1_v2在肿瘤增殖中起到抑制作用。Gao等[22]使用Ficoll-Paque方法分离来自白血病患者和健康人群的外周血白细胞样品并对Neat1_v1和Neat1_v2进行分析，发现白血病样本中Neat1_v1的表达水平低于正常样本，而Neat1_v2表达水平却与正常样本相似。从上述研究可以得出，这2种Neat1变体表达的动态变化可能影响Neat1作为癌基因或肿瘤抑制因子的主要功能。目前对Neat1_v1和Neat1_v2在肝细胞癌中的表达模式和作用的研究还十分有限，迫切需要进一步研究来阐明Neat1_v1和Neat1_v2这2种变体在肝细胞癌发生、发展中的确切作用。

综上所述，本研究结果提示肝细胞癌组织及肝癌细胞株中LncRNA Neat1表达明显降低，肝细胞癌组织LncRNA Neat1表达与肿瘤分化程度密切相关。LncRNA Neat1有望成为诊断肝细胞癌的新型肿瘤标志物。然而，本研究未阐明LncRNA Neat1在肝细胞癌中发挥作用的具体机制，需要进一步研究明确。