新型NIH 稀毛小鼠行为学特性的研究报告

赵耀东，胡进平，陶博强，，胡浩博，刘映坤，王东旭，陈 健*

1.吉林大学实验室与设备管理处，吉林长春 130000；2.吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062；3.吉林大学口腔医院，吉林长春 130021

稀毛小鼠作为珍贵的动物模型，在生命科学和医学研究中具有重要的作用，尤其是在皮肤病模型、肿瘤模型方面。因为小鼠表现为无毛或被毛稀疏，所以在进行很多疾病研究之前不需要脱毛，而且在研究过程中表型更容易观察到。裸小鼠是一种常见的被毛突变小鼠，常用于神经系统、呼吸系统、消化系统、生殖系统等疾病的模型构建。除了裸小鼠外，最常用的无毛小鼠是SKH1。SKH1 小鼠的毛发缺失和色素沉着导致它们被广泛用于光生物学和光致癌研究。然而，这种小鼠模型的一个主要缺点为它们是异种繁殖的。NIH 小鼠，即NIH Swiss mouse，是美国国立卫生研究所培育的一种远交群小鼠。新型NIH 稀毛小鼠是2007 年在正常的NIH小鼠封闭群的繁育过程中发现的自发突变小鼠，表现为毛发稀疏、无胡须，之后就以近交系的繁育方式将这一自发突变小鼠保留了下来。自发基因突变小鼠模型缺少了人为因素的干扰，在疾病发生的过程与相应人类疾病的发生更加贴合。由于对NIH 稀毛小鼠的遗传规律、免疫能力等生物学特性尚不清楚，为了便于后续研究观察，因此需要对新型NIH稀毛小鼠的生物学特性进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验所用NIH 稀毛小鼠保种繁育以及饲养于吉林大学实验动物中心（SCXK（吉）2016-0001），SPF 级NIH 小鼠购买自长春生物制品所有限公司（SCXK（吉）2017-0005）。

1.2 实验试剂与仪器

氯仿、无水乙醇、异丙醇（北京化工厂）；移液吸头、EDTA 抗凝管和离心管购置NEST 公司。

高压灭菌器购自厦门致微；电子天平购自Mettler Toledo；多功能酶标仪购自Bio-Tek；恒温培养箱和恒温振荡器购自上海一恒；血细胞分析仪购自IDEXX；独立送风笼具和超净工作台购自苏州冯氏；干式生化仪购自FUJI DRI-CHEM NX500iVC，高速冷冻离心机购自Thermo；光学显微镜购自Nikon；Morris 水迷宫分析软件选用Panlab，SMART 3.0。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验

本文葡萄糖耐量实验所用葡萄糖剂量为1 g/kg（一般用量为1.5 ～2 g/kg），配制10%葡萄糖的生理盐水溶液，小鼠从前一天下午17:00 至次日上午9:00 共计禁食16 h，饮水正常。注射前称重标号，测定血糖，按体重腹腔注射0.01 mL/g 剂量的葡萄糖，每2 只之间间隔1 min，注射后在15、30、60、90 min各测一次血糖。实验结束后正常饲养。根据小鼠的性别和年龄决定胰岛素用量，以注射30 min 后葡萄糖水平下降至之前的40%左右为宜。小鼠上午不禁水，禁食4 h。下午称重标号，测定血糖含量。生理盐水稀释胰岛素，根据体重注射剂量1 U/kg，注射后在15、45、60、90、160 min 各测一次血糖。实验结束后正常饲养。

1.3.2 Morris 水迷宫实验

实验前加水开机调试水迷宫，加入6 mL 蓝墨水以加深背景色。水池所有功能运行正常。加热板预热至50 ～60 ℃，使用白毛巾来为小鼠游泳后恢复状态。

Morris 水迷宫实验分为定向航行实验和空间探索实验共计两部分内容。先进行为期3 d 的定向航行实验。每只小鼠学习3 d 共计16 次，第1 天学习4 次，之后第2 ～3 天每天学习6 次。每两次学习间隔至少30 min。水迷宫划分为4 个象限，学习时小鼠面向壁，放入不同象限开始学习。在其中一个象限中央位置设置目标平台（目标象限），实验结束标准为小鼠游至平台并停留1 s 或达到60 s的实验时长。其中未到目标平台的小鼠引导到目标平台后使其停留10 s。每次实验后将小鼠放在加热板。记录小鼠游动到平台的时间和距离，其中游动时间即为逃避潜伏期。

定向航行实验结束后的24 h 内完成空间探索实验。实验时撤走目标平台，之后在目标象限的对侧象限轻轻放入小鼠，计时60 s。实验记录小鼠在目标象限游动时间和游动距离的比例，以及小鼠进入目标象限的次数。

1.4 统计学方法

所有实验数据均表示为平均数± 标准差（x±s)，并对各项数据进行正态性检验，实验结果的性别及组间分析比较采用配对t 检验，所有数据分析使用SPSS 统计学软件。其中p＜0.05 与p＜0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验

在葡萄糖耐量实验（GTT）中，NIH 稀毛小鼠（HL）空腹和静息状态下血糖值比正常NIH 小鼠低。并且NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖盐水溶液15 min 后，其血糖值与正常小鼠相比显著降低，糖耐量增高（图1 所示）。在胰岛素耐量实验中，NIH 稀毛小鼠与正常小鼠的胰岛功能均正常，无区别（图2 所示）。

图1 葡萄糖耐量实验结果

注：纵轴是血糖（mmol/L），横轴是时间(min)，其中***表示p＜0.001。

图2 胰岛素耐量实验结果

2.2 NIH 稀毛小鼠学习记忆能力

Morris 水迷宫的定向航行实验表明，雄性NIH稀毛小鼠在训练第3 天逃避潜伏期比正常雄性NIH小鼠显著降低，同时雌性NIH 稀毛小鼠比正常雌性小鼠极显著降低（图3B）。第3 天学习时雌性NIH稀毛小鼠比正常NIH 小鼠的游动距离显著降低，这是因为游行时间缩短（图3A）。空间探索实验表明，NIH 稀毛小鼠比正常NIH 小鼠进入目标象限次数显著增加（图4B）。其中在目标象限的游动时间和游动距离方面，雄性NIH 稀毛小鼠所占的比例高于正常NIH 小鼠，且差异显著（图4C，D）。

图3 定向航行实验结果

图4 空间探索实验

3 讨论

迄今为止，一些无毛小鼠品系已被用于研究免疫反应、肿瘤发生、皮肤发育及其他问题，其中一些最为常用的品系如SKH1 等。自发稀毛突变的小鼠是研究毛囊发育和毛发生长的重要的动物模型。皮肤作为人体的第一道免疫屏障，其功能与全身免疫系统、神经系统和内分泌系统密切相关。NIH 稀毛小鼠作为一种新型的自发突变的实验动物，可以为挑选疾病动物模型提供一种新的选择。但是目前为止对NIH 稀毛小鼠的研究极少，其生物学特性还尚不确定，为此我们对NIH 稀毛小鼠的部分生物学特性进行了研究。本课题从遗传规律、保种方式、内分泌系统、神经系统等方面入手，对NIH 稀毛小鼠进行了初步了解。

在这之前有研究表明，NIH 稀毛小鼠在P7 和P42 时，毛发稀疏，特征明显。我们的研究结果也支持这一观点，在P7，P42 时NIH 稀毛小鼠表型为无毛、无胡须，与NIH 正常小鼠差异显著，并能轻易区分。无毛小鼠非常适合进行伤口愈合研究，因为正常小鼠需要脱毛可能造成二次创伤，并且毛发的再生会掩盖伤口，导致伤口的愈合情况不容易直接观察。糖尿病一个明显特征就是伤口愈合缓慢。糖耐量实验是识别糖耐量受损的唯一方法，也是判断糖尿病患者的重要方法。根据给药途径的不同，可以分为口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和腹腔内葡萄糖耐量实验（IGTT）两类。Andrikopoulos 曾研究了不同给药途径以及不同禁食时间对小鼠GTT 实验的影响，结果表明GTT 可用来识别糖耐量受损和糖尿病。为了研究该NIH 稀毛小鼠血糖是否正常以及是否适用于建立糖尿病疾病模型，本研究进行了葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。结果显示，NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖后15 min 血糖值显著低于正常小鼠，糖耐量增高，但是胰岛功能是正常的。这提示NIH 稀毛小鼠可能存在糖代谢异常，其糖代谢异常的机制尚不明确，需要将其作为糖尿病模型的时候值得注意。

生物发光成像(BLI)是一种监测小鼠大脑基因表达时空动态的强大技术。然而，在小鼠发育和日常检查期间，脱毛后的黑毛、皮肤色素沉着和毛发再生干扰了BLI。先前有研究表明，在成人的大脑和皮肤中都可以检测到Hr mRNA 的高表达。Morris水迷宫实验是一项对啮齿类动物的空间学习测试，并且已被证明是一项与海马突触可塑性和NMDA 受体功能密切相关的可靠测试。Duan、Ebrahimpour还有Chen 等通过Morris 水迷宫实验，研究了小鼠在水迷宫路线的长度和老鼠找到站台所需的时间与小鼠学习记忆能力的关系。结果证明，随着训练次数的增多，小鼠表现出了一定的空间学习能力。为了确定NIH 稀毛突变是否会对脑组织以及神经发育产生影响进而影响其作为神经认知有关的动物模型的价值，本研究进行了Morris 水迷宫实验来检验稀毛小鼠的学习记忆能力。研究结果显示NIH 稀毛小鼠的学习能力较正常小鼠显著增强，且NIH 稀毛小鼠记忆力的增强与性别无关，雄性和雌性的NIH稀毛小鼠均有所升高。然而Hr 基因突变是否与海马神经突触有关以及影响小鼠学习记忆能力的相关机制需要进一步研究。

NIH 稀毛小鼠是一种新型的自发突变的小鼠。因为其毛发稀疏、无胡须的表型而受到研究人员的关注。在本研究中，确定NIH 稀毛小鼠符合孟德尔遗传定律中单基因控制的，且根据近交系的交配法则，获得了性状显著且稳定遗传的种群。葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验证明了NIH 稀毛小鼠与NIH 正常小鼠相比，糖耐量增高，代表其糖代谢受损或存在内分泌异常，但是胰岛素敏感性没有明显改变。Morris 水迷宫实验证明了NIH 稀毛小鼠拥有一定的学习记忆能力。通过本次研究，明确了NIH 稀毛小鼠的部分生物学特性，为其近一步运用于生物发光成像、动物皮肤病模型、肿瘤模型等提供了新的模型。