番茄Pti6基因遗传转化与分析

张 政, 王莹莹, 冯国栋, 王瑞鹏, 徐焕焕, 牛向丽

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

番茄是广泛种植的果蔬类重要经济作物,同时也是研究果实发育、植物病害的模式植物[1-2]。为保障其产量、品质,需要防治病害的发生。因此,对抗病番茄品种的培育及其抗性机理的探讨成为一个重要的研究内容。

植物在与病原微生物的攻防协同进化中形成了复杂的防御机制,包括对病原微生物的感知、信号转导、抗病基因表达,最终激活抗病相关酶,合成防卫次生代谢物[3-5]。如过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase,PAL)等,在植物受到病原菌侵袭时表达量升高、活性增强,参与活性氧清除和酚类等抗病代谢物质的合成,以增强植物对病害的防御能力[6]。

番茄Pto基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是抵御丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)的重要抗性蛋白。它通过与效应蛋白Avrpto/AvrptoB结合感知病原菌,启动防御途径,但对其抗病分子途径尚未完全阐明[7-8]。Pti6是可以与Pto互作的蛋白之一,编码转录因子，被认为是Pto介导抗病途径的下游基因[9]。本研究通过农杆菌介导方法进行番茄遗传转化,以获得Pti6过量表达的转基因植株,可以对其功能进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 番茄材料

野生番茄(Solanumlycopersicumcv. AC+)来自美国康奈尔大学植物研究所。

1.1.2 质粒和试剂

植物表达载体pBI121、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105由本实验室保存;高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购于TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、植物基因组提取试剂盒、RNA提取反转录试剂盒以及定量PCR试剂盒购于TransGen公司;植物组织培养试剂购于Sigma公司;其余试剂均为进口分装或国产分析纯;引物合成和测序由生工生物工程有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 农杆菌介导番茄遗传转化

选取野生型番茄AC+种子,75%乙醇浸泡1 min后以无菌水清洗,再以15%次氯酸钠溶液处理15 min,灭菌水反复清洗。将表面灭菌的种子转移至无菌滤纸上,待水分吸干后,均匀放于1/2MS培养基,28 ℃,暗培养。约3 d种子露白后,将其移至光照条件下生长。培养约7 d后,在超净工作台中将无菌番茄幼苗叶子和茎剪下,将叶片以镊子戳孔和茎段分别放置于预培养基MS(20 g/L 蔗糖,1 g/L 6-苄氨基腺嘌呤,1 g/L 吲哚乙酸)诱导愈伤组织形成。

将转入Pti6过表达载体pBI121-Pti6的农杆菌在带有利福平(Rifampicin,Rif),10 mg/mL和卡拉霉素(Kalamycin,Kana),50 mg/mL的LB培养板上划线,28 ℃培养2 d。挑取单克隆于带有Rif和Kana的LB液体培养基,28 ℃培养过夜。然后将菌液进行扩大培养至OD600为0.6～0.8时,5 000 r/min离心5 min,弃上清。将菌体在灭菌诱导液(pH=5.6、0.5 mol/L磷酸缓冲液,1 g/L NaCl,0.15 g/L KCl,0.15 g/L CaCl2·2H2O,2.5×10-3mg/L FeSO4,0.03 g/L MgSO4·7H2O,200 g/L 葡萄糖,0.5 mol/L 2-吗啉乙磺酸,0.2 mol/L 乙酰丁香酮)中重悬,侵染植物茎、叶愈伤组织15 min。以灭菌滤纸吸干多余菌液,将侵染的叶片和茎段置于共培养基MS(20 g/L 蔗糖,1 g/L 激动素,1 g/L 2, 4-二氯苯氧乙酸,0.2 mol/L乙酰丁香酮),25 ℃光照培养2 d。依次用不同质量浓度的卡那霉素(60、65、70 μg/mL)培养基进行梯度筛选培养各约25 d。待愈伤组织分化后将形成的番茄小苗转入生根培养基MS(20 g/L蔗糖,0.1 g/L羧苄青霉素,50 mg/mL 卡那霉素,1 g/L吲哚乙酸),根系发育完全后移栽入营养土中,在温室里生长。

1.2.2 Pti6过表达番茄植株鉴定

通过遗传转化将Pti6基因、筛选标记基因NPTⅡ(新霉素磷酸转移酶Ⅱ)共同转入植物基因组中。以筛选标记基因设计引物NPTⅡF/R见表1所列,野生型番茄基因组DNA为负对照、pBI121质粒为阳性对照,进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增,以初步鉴定阳性转基因植株。

进一步设计real-time定量PCR[10-11]引物RTPTI6F和RTPTI6R,见表1所列,以UB13作为内参基因,分别提取野生型、Pti6过表达阳性植株的叶片RNA,反转录合成cDNA作为模板,进行定量PCR扩增,检测Pti6基因的表达水平。

表1 本研究所用引物序列

1.2.3 Pti6过表达对CAT、POD的影响

以液氮将番茄外果皮研磨成粉末,取0.2 g于1.5 mL EP管中,加入1 mL冰上预冷的PBS溶液(0.1 mol/L KH2PO4,0.1 mol/L Na2HPO4,pH 值7.0),充分混匀,低温(4 ℃)10 000g离心10 min,上清即为粗酶液,进行以下测定。

(1) CAT量的测定[12]。吸取30 μL粗酶液,加入240 μL 0.05 mol/L PBS缓冲液,混匀后置于酶标板中。迅速加入30 μL 0.1 mol/L 过氧化氢溶液,震荡5 s后立即测定240 nm吸光度,每隔30 s再测量1次OD240,连续测量10次。每g番茄中CAT物质的量的计算公式为:

其中,ΔA240/t为吸光值的变化斜率,ΔA240为变化值;Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;FW为番茄样品质量。

(2) POD量的测定[13]。吸取60 μL粗酶液,加入210 μL 0.3%愈创木酚,30 ℃孵育10 min。加入0.1 mol/L过氧化氢溶液,震荡5 s后立即测定470 nm吸光度。每隔30 s再测量1次OD470,连续测量10次。每g番茄中POD物质的量的计算公式为:

其中,ΔA470/t为吸光值的变化斜率,A470为变化值;Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;FW为番茄样品质量。

(3) MDA量的测定[14]。吸取300 μL粗酶液,加入0.5 mL的0.5% TBA溶液(0.5%硫代巴比妥酸,10%三氯乙酸),95 ℃加热20 min后迅速冰浴5 min,然后4 ℃,1 000g离心10 min。取300 μL上清液于酶标板中,检测450、532 、600 nm吸光度。每g番茄中MDA物质的量的计算公式为:

n(MDA)=

其中,Vt为提取酶液体积;Vs为反应体系中提取液体积;FW为番茄样品质量。

各实验重复3次。测定数据利用SPSS进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Pti6基因过表达植株的获得

利用农杆菌介导法对Pti6基因进行番茄遗传转化。Pti6基因番茄遗传转化如图1所示,经过愈伤组织诱导、农杆菌侵染、筛选培养、组织分化和再生,最终获得11株独立的Pti6过表达转基因植株。

图1 Pti6基因番茄遗传转化

2.2 Pti6过表达番茄植株鉴定

分别提取野生型AC+和Pti6转基因植株的基因组DNA,以筛选标记基因NPTⅡ特异引物进行PCR扩增。结果显示,转入基因的番茄植株扩增得到与正对照相同的约750 bp的预期条带,而野生型未有扩增条带如图2a所示,表明已获得转基因阳性番茄植株。进一步提取野生型、阳性植株RNA,反转录后进行定量PCR。Pti6表达水平如图2b所示。

图2 Pti6过表达植株鉴定

图2中,M表示DNA Marker;P表示pBI121质粒,阳性对照;1～11分别表示Pti6转基因番茄植株;N表示野生型番茄,阴性对照;*表示与野生型相比有显著性差异(P<0.05)。

图2结果表明,已获得了Pti6表达水平高于野生型的3个独立的过表达植株(分别命名为OE-1、OE-2和OE-3)。鉴定结果表明,植物表达载体插入片段已在番茄基因组中整合,并表达了过量的Pti6基因。

2.3 CAT、POD及MDA量的测定

本文对野生型、过表达植株(OE-1、OE-2、OE-3)果实中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)及丙二醛(MDA)的量分别进行测定。Pti6过表达番茄果实中CAT、POD及MDA的量如图3所示。

图3 Pti6过表达番茄果实中CAT、POD及MDA的量

结果表明与野生型相比,Pti6过表达番茄果实中CAT、POD的量显著提高,而MDA的量有所降低,说明Pti6基因表达水平的提高可以增强防御酶CAT、POD的活性,降低膜系统的损伤。图3中相同字母表示无显著差异,不同字母表示有显著差异(P<0.05)。

3 结 论

本实验中利用农杆菌介导进行Pti6基因遗传转化,经基因组DNA、RNA水平的鉴定,获得Pti6基因过表达番茄植株,并进一步对Pti6过表达植株果实表型进行了初步分析。

过氧化氢酶(CAT)可以将过氧化氢分解为水和氧气,使植物体免受H2O2的伤害[15-17]。过氧化物酶(POD)作为植物体内重要的呼吸酶类,它的活性高低直接影响了酚类物质的代谢,并且与病原微生物的抗性密切相关,是反映植物抗性的一个重要指标[18]。它们均对植物起着重要的逆境保护作用。在Pti6过表达番茄果实中CAT、POD活性显著提高。相应地,作为植物体内膜脂过氧化物重要产物之一,同时也是膜系统损伤程度、植物抗逆性重要反映指标的丙二醛(MDA)[19-20],在Pti6过表达番茄中有所降低。表明Pti6可能通过促进抗病相关基因的转录表达,最终使防御酶活性增强,在宿主保护、抑制病原微生物生长中发挥作用。

通过后续对本工作中所获得Pti6过表达番茄株系的进一步扩繁,进行较大规模植物叶片、果实病原菌接种实验,并对Pti6过表达植株中激活的下游基因进行分析,将有助于对Pti6功能以及Pto介导的抗病分子途径的深入了解。