FADS2对鸡前脂肪细胞脂肪酸代谢相关基因表达的影响

欧小倩， 王 莹， 何程实， 李春晖， 刘国庆， 杨少华

(合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601)

多不饱和脂肪酸(PUFAs)作为一种生物活性物质，对人和动物有重要的生理功能。其中，n-6和n-3多不饱和脂肪酸在人和动物体内都发挥着重要作用，作为合成类二十烷酸化合物的前体共同调节生物体的生命活动，广泛参与脂类代谢调控基因表达、稳定细胞膜功能及促进生长发育等[1-2]。多不饱和脂肪酸在多种生理过程中起着至关重要的作用，它们作为生物膜的主要成分参与结构功能[3]、代谢能的产生、转录因子的配体和细胞通路中的信使[4]。多不饱和脂肪酸可由膳食提供，还可以由必需脂肪酸亚油酸和亚麻酸在体内通过一系列去饱和及碳链延长过程获得。对于禽类而言，多不饱和脂肪酸的含量直接影响肉质风味[5]。肉品嫩度是衡量肉质的重要因素，肌内脂肪对肉嫩度的影响较大。多不饱和脂肪酸能促进脂肪降解，减少体脂沉积[6]，因此多不饱和脂肪酸通过降低嫩度影响肉质风味。

相关研究表明，不饱和脂肪酸对脂肪合成具有抑制作用，增加不饱和脂肪酸比例会增加脂肪氧化酸败程度，导致肉品质下降[7]。截至目前，关于调控家禽脂肪酸含量机理的研究尚少，因此开展这方面的研究具有重要意义。前期通过候选基因分析策略，虽然找到了一些影响鸡肉品质的主效基因(例如脂肪酸合成酶(FASN)、超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)等)，但很多关键基因还无法得到分离和鉴定, 因此高通量检测的研究手段刻不容缓。基于此，本课题组前期通过对具有极端高、低多不饱和脂肪酸比率的黄山黑鸡腿肌组织进行转录组测序分析，整合差异表达基因、己报道的影响鸡肉脂肪酸代谢的QTL及基因的生物学功能分析，从而确定FADS2为影响肌肉中多不饱和脂肪酸含量的候选基因。

脂肪酸脱氢酶(FADS)是一类催化脂肪酸酰基链特定位置C—C脱氢形成C=C的脱氢酶家族，能够催化脂肪酸生成多不饱和脂肪酸[8]。脂肪酸脱氢酶2(FADS2)是脂肪酸脱氢酶家族成员之一，是多不饱和脂肪酸合成代谢途中关键的限速酶。在生物体内，具有维持膜的正确结构和调节脂肪酸代谢等重要作用。FADS2基因可以通过调节脂肪酸代谢，从而影响鸡肉的肉质风味[9]。文献[10]的研究发现，FADS2基因3′端非编码区SNP突变会对中国荷斯坦牛乳中脂肪酸组成产生重要影响；文献[11]在对鸡的研究中发现，鸡FADS2基因5′侧翼区的G-997C和C-1402T 2个突变位点影响肌肉脂肪酸的含量，并且对鸡前期生长速度影响较大。文献[12]研究发现，FADS2基因3′UTR区部分SNP突变及其单倍型对乳中脂肪酸含量具有显著影响。

鉴于FADS2基因在畜禽脂肪酸代谢方面的重要作用，本文通过慢病毒介导的表达载体干扰沉默鸡前脂肪细胞中的FADS2基因，筛选FADS2基因影响脂肪酸代谢的相关下游基因，从而探究FADS2基因对鸡脂肪酸代谢的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

鸡前脂肪细胞，本实验室分离培养;鸡前脂肪细胞完全培养基购自武汉普诺赛有限公司；25 cm培养瓶、6孔细胞培养板购自南京凯基生物科技有限公司；293T细胞由中国科学院细胞库提供；重组穿梭质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G购于苏州吉玛；Lentivirus-病毒液购自Genepharma；RNAi-Mate 转染试剂购自苏州吉玛；总RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司；实时荧光定量通用试剂(Cat# GMRS-001 吉玛, 上海)。

1.2 方法

1.2.1 鸡前脂肪细胞的分离及培养

鸡前脂肪细胞的分离参照文献[13-14]。将消化分离出来的细胞稀释并吹打均匀，细胞计数器计数，以1×104个/cm2的密度接种于25 cm培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，用PBS清洗3～5次，除去未贴壁的细胞之后每1～2 d换1次培养液，并观察拍照。

1.2.2 shRNA干扰序列的设计与合成

根据RNAi设计原则，设计鸡FADS2基因的RNA干扰片段FADS2-shRNA，由苏州吉玛公司合成处理，序列信息见表1所列。

表1 设计合成的shRNA序列信息

1.2.3 shRNA有效片段筛选

将鸡前脂肪细胞消化后接种于24孔板中，待细胞达到60%左右汇合度时，分别加入慢病毒FADS2-259(F1)、FADS2-498(F2)、FADS2-618 (F3)，同时以空病毒载体作为对照组。48 h收集细胞，提取总RNA，参照试剂盒说明提取，用于荧光定量检测FADS2的干扰效率。引物设计见表2所列。

表2 引物相关信息

1.2.4 FADS2基因的干扰实验

将筛选得到的一组有效干扰FADS2的shRNA，同上述操作，感染鸡前脂肪细胞，提取总RNA，用于荧光定量检测FADS2干扰效率。

1.2.5 基因表达检测

将检验合格后的鸡脂肪细胞RNA根据其测得的浓度分别取3 μg来构建RNA池，用于转录组的文库构建。利用转录组测序分析阴性对照(NC)组及干扰(GR)组中差异表达基因。

1.2.6 构建cDNA文库及转录组序列

样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)富集得到最终的cDNA文库。建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。

1.2.7 测序数据分析

高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，以FASTQ文件格式存储。获得原始测序序列后，通过去除带接头的reads，去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads和低质量的reads，获取clean reads。之后，使用HISAT软件将获取的clean reads进行基因组定位分析。

1.2.8 差异表达及功能富集分析

使用DESeq R软件包(1.10.1)对NC(control)组和干扰(GR)组进行差异表达分析。将|lb Ratio|≥1和FDR≤0.05作为显著性标准阈值。筛选差异表达基因后，通过基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。以P≤0.05为阈值，筛选满足此阈值的差异表达基因显著富集的GO条目。

2 结果与分析

2.1 FADS2基因干扰效率检测

荧光定量检测FADS2基因干扰效率如图1所示，图1中，B表示空白对照组；NC表示阴性对照组；F1表示干扰片段1；F2表示干扰片段2；F3表示干扰片段3。

图1 荧光定量检测FADS2基因干扰效率

以B组为校准，ACTB为内参，FADS2基因的表达水平定量结果表明，与对照组相比，F1、F2、F3组FADS2的mRNA表达水平分别降低了60%、34%、4%。根据筛选干扰片段的条件(干扰效果>50%)，F1片段已经达到有效的干扰效果，因此可以用于后续的检测试验。

2.2 FADS2基因干扰实验结果

将有效干扰片段F1转染细胞72 h后的图片(放大100倍)如图2所示。

图2 转染效率荧光情况

由图2可知，转染效率在70%左右，细胞生长状况良好。

2.3 鸡前脂肪细胞的RNA测序

干扰组1(GR 1)、干扰组2(GR 2)、阴性对照组1(Control 1)和阴性对照组2(Control 2)测序序列经过测序数据过滤后，共获得清晰读取数据232 535 kB，每个样本的平均数为58 134 kB(范围是50 794～65 430 kB)，详细信息见表3所列。

表3 每个样品的基本测序数据

2.4 差异表达基因的鉴定

使用RPKM方法，检查了NC(control)组和干扰(GR)组之间的差异表达基因表达谱。NC(control)组和干扰(GR)组共检测到190个差异表达基因，其中65个基因下调(左边部分)，125个基因上调(右边部分)，NC(control)组和干扰(GR)组火山图如图3所示。使用RNA-Seq和基因功能的综合分析，筛选出FADS2可能的11个下游基因，见表4所列。

图3 差异表达基因的火山图

表4 FADS2调节脂肪酸代谢的11个下游基因

2.5 差异表达基因的功能富集分析

通过DAVID生物信息学资源进行了GO通路富集分析。结果显示，与脂肪酸代谢过程有关的8个GO生物过程项显着富集(P<0.05)。其中包括对脂质的反应(GO:0033993)，膜脂质生物合成过程(GO:0046467)，细胞对脂质的反应(GO:0071396)，甘油脂生物合成过程(GO:0045017)，蛋白质脂化(GO:0006497)，甘油磷脂生物合成过程(GO:0046474)，甘油脂生物合成过程(GO:0045017)，脂蛋白生物合成过程(GO:0042158)，详细信息见表5所列。

表5 差异表达基因的GO分析

2.6 下游基因

通过综合分析差异表达基因、通路富集和基因功能，本文可以鉴定出STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3可能是FADS2基因影响脂肪酸代谢的11个下游基因，具体信息详见表4所列。

3 讨 论

近年来，RNA-Seq已经成为研究基因表达分析转录谱的有力工具[15]。作为转录组研究工具的新方法，RNA-Seq是一种高度敏感和准确的检测手段[16]。在鸡中，RNA-Seq已成功应用于鸡肉味器官的分析[17]、筛选差异表达的基因[18]、不同的脂肪酸生物合成机制[19]和胸肌剪切力[20]等研究。本研究将鸡前脂肪细胞中的FADS2基因干扰沉默后，利用转录组测序技术筛选出FADS2影响的相关下游基因，为后续的研究奠定基础。同时，本研究开展了3个重复实验，减少了实验误差，避免了实验的偶然性，保证了实验结果的准确性。

本研究利用RNA干扰技术，通过慢病毒介导的表达载体干扰沉默鸡前脂肪细胞中的FADS2基因[21-22]。本实验所用慢病毒载体是以第三代载体系统为基础，通过一定改建，构成四质粒体系。同时，采用“自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。与常规的原代细胞转染结果相比，本实验通过慢病毒包装载体转染目的细胞，转染效率高达70%，极大地提高了转染的效率。

通过转录组测序检测干扰结果，共检测到190个差异表达基因。其中11个基因受FADS2基因的调节，包括STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3。其中，脂肪酸结合蛋白(FABP)是一种参与长链不饱和脂肪酸代谢的小分子蛋白[23]，并且能够协助动物组织细胞内的脂肪酸转运。

脂肪酸结合蛋白5(FABP5)和脂肪酸结合蛋白3(FABP3)属于脂肪酸结合蛋白家族(FABPs)，是一种胞内脂质运载体[24]，在本研究中均显著下调。文献[25]研究发现，FABP5对硬脂酸和亚油酸具有高度亲和力，并通过调节细胞内脂肪酸的转运来调控脂质代谢。文献[26]将FABP5基因转到田鼠中发现，FABP5基因在脂肪细胞中过表达会加快脂肪分解代谢。另一个脂肪酸结合蛋白家族成员FABP3基因，参与胞内脂肪酸的短暂存储和运输[27]。文献[28]研究发现，FABP3基因能结合脂肪酸等疏水性分子或有机阴离子。文献[29]在研究中发现，FABP3基因遗传信息的变化会直接或间接调控羊奶成分与脂肪酸的组成。因此，FABP5、FABP3基因可能通过调节鸡前脂肪细胞中脂肪酸的转运、合成和遗传调节脂肪酸的代谢。

同样ACTA1、SLC5A6、KLF2、KLF4和LY86基因的表达水平在鸡前脂肪细胞中也显著下调。骨骼肌α-肌动蛋白1(ACTA1)主要分布在骨骼肌细胞内，文献[30]在对延边黄牛的研究中发现，ACTA1基因的表达水平与肌内脂肪含量呈显著负相关，该基因可能参与延边黄牛脂肪沉积的调控。溶质载体家族5成员6(SLC5A6)会产生人钠依赖性多种维生素转运蛋白(hSMVT)，hSMVT在多种细胞系统中介导脂肪酸摄取[31]。

KLFs家族参与细胞的生长、增殖和分化，并在脂肪细胞的增殖分化调控中也有作用。其中，KLF2在脂肪细胞分化中具有重要的调控作用。文献[32]研究发现，KLF2基因在牦牛肺脏和脂肪组织中的表达水平最高，并且在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量呈正相关。文献[33]对鸡KLF2基因的表达分析中发现，KLF2基因是鸡脂肪细胞分化的负调控因子，可以通过抑制PPARγ和C/EBPα基因表达从而抑制脂肪细胞分化[34]。KLF4基因是参与脂肪代谢和脂肪组织形成的主要基因[35]。以上的诸多研究均与本研究的结果相吻合。然而，截至目前，没有研究将LY86与脂肪酸代谢联系起来，因此对该基因的进一步研究是有必要的。

另一方面，STAT1、NCOA7、ACSL5和OGFR基因的表达水平在本研究中显著上调。转录激活因子1(STAT1)在干扰素信号转导过程中发挥着重要作用[36]。已有研究表明，STAT1的表达水平与脂肪沉积呈正相关[37]。核受体共激活物(NCOA7)参与不同核受体(如ESR1、THRB、PPARG和RARA)的共激活作用。而PPARG是目前发现的在脂肪组织中调控脂肪酸代谢的核心转录因子[38]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员5(ACSL5)是长链脂肪酸-辅酶A连接酶家族的同工酶，该家族所有同工酶都能将游离的长链脂肪酸转化为脂肪酰基辅酶A脂，从而在脂质生物合成和脂肪酸降解中发挥关键作用。文献[39]在研究中发现，ACSL5在脂肪肝发展过程中起重要作用。相关研究表明，ACSL5主要在三酰甘油合成率高的组织中表达，表明ACSL5在脂质合成代谢中具有重要作用[40]。这些研究为本研究结果提供了佐证。然而，OGFR基因的具体生物学功能尚不清楚，需进一步研究以了解该基因在脂肪酸代谢分子机制中的作用。

4 结 论

本研究通过慢病毒介导的表达载体对鸡前脂肪细胞中的FADS2基因干扰沉默后，有效RNA进行转录组测序，共检测到190个差异表达基因。通过综合分析差异表达基因、通路分析和基因功能，确定STAT1、LY86、FABP5、OGFR、ACTA1、SLC5A6、NCOA7、KLF2、KLF4、ACSL5和FABP3这11个基因可能是FADS2基因影响的下游基因，为后期的研究提供了一定的理论依据。