56℃水浴灭活处理对红细胞血型抗原影响的研究*

赵俸涌 郭忠慧 李勤 杨启修 朱自严

破坏微生物的生物学活性称之为灭活，此外灭活在血浆制品制作流程中还指破坏血清中补体的活性，灭活方法均对微生物可激发人体免疫应答的保护性抗原产生较小影响[1]。通常对于含有致病病毒的体液及血液等液体样本（如含有COVID-19的体液或血液样本），灭活方法通常采用56℃水浴30分钟的方法进行[2]。

输血前患者需要进行血型鉴定与配血以降低输血免疫风险，红细胞血型血清学鉴定依赖抗体对红细胞表面抗原特殊空间结构的识别，物理、化学及生物处理都会对红细胞抗原空间结构造成破坏。已有研究表明，保存损伤对血型抗原存在一定影响，其原因主要是膜骨架稳定性下降后，膜蛋白空间结构发生了变化[3,4]。在保存老化试验中，通常以37～42℃水浴作为老化模拟[5]。新型冠状病毒肺炎（COVID-19）流行以来，血液样本需经水浴灭活处理后方可进行后续试验，而灭活中56℃水浴条件较37℃对红细胞结构及红细胞表面膜蛋白结构影响更大。而灭活程序对红细胞血型抗原的影响及进一步对血清学检测实验灵敏度的影响还未见相关报道。因此，本研究通过对血液样本灭活后进行抗原检测，以评估灭活程序对红细胞血型抗原检测的影响。

材料与方法

1 样本制备 血样来自本研究室人员志愿提供，共5例RhD、Fya阳性全血（AB型3例，B型1例，O型1例），全血EDTA•2K抗凝后，将每例样本分为两组、每组1 mL分装，模拟灭活组置于56℃水浴，灭活30 min。对照（control）组置于室温30 min。

2 试剂与仪器

2.1 主要试剂：抗-A单克隆抗体（BRIC131，BRIC）,抗-B单克隆抗体（ES-4,BRIC）、抗-D单克隆抗体（RUM-1，BRIC）BRIC，抗-Fya单克隆抗体（P3TIM, Sanquin），微柱凝胶卡[抗人球（Bio-Rad）：50531.38.18 盐水（Bio-Rad）：50520 59 08]。

2.2 主要仪器：孵育仪（Incubator 37 SI），凝胶卡离心机（Centrifuge 12 S Ⅱ）。

3 抗体滴定 抗-A、抗-B、抗-D、抗-Fya试剂滴定至凝集强度保持约4+的临界点（各抗体滴定度见表1）。

表1 血型检测试剂稀释表

4 A、B、RhD、Fya抗原血清学检测 将上述待测红细胞样本使用PBS在血清学离心机中3次洗涤后，配制1%红细胞悬液待用。采用标定后的抗-A、抗-B、抗-D对上述样本进行凝胶卡法检测。将抗体继续用2倍稀释法制备梯度抗体，并依据说明书进行凝胶柱法检测，记录凝集强度结果，凝集打分依据见图1。

图1 微柱凝胶卡检测评分表

结 果

1 水浴灭活对样本外观及结果判断的影响 水浴灭活后，血液样本发生溶血，血浆颜色发生明显变化，导致无法对溶血性抗体进行判读，结果见图2。

2 细胞形态 通过显微镜观察后发现，灭活后红细胞形态发生形变、皱缩、出棘等现象（图3）。

3 水浴灭活对血清学检测血型抗原的影响 通过标定抗体对各抗原进行凝胶柱法检测后发现，A、B抗原在各个稀释度中均未出现具有统计学意义的差异，见图4A、图4B；而RhD抗原在各稀释度检测时均出现统计学差异（8倍稀释时：P＜0.05；16～256倍稀释时：P＜0.01），见图4C，Fya抗原在各稀释度检测时均出现统计学差异（P＜0.05）。打分结果统计见图4。

图2 56℃灭活对血液样本外观影响（n=5）

图3 灭活前后细胞形态学变化（40×明场）

图4 不同稀释度对灭活处理后细胞抗原检测变化趋势图

讨 论

哺乳动物成熟红细胞不具有细胞核，其发挥生理功能主要依靠膜蛋白。同时众多血型抗原的生物学基础也是红细胞膜蛋白或其糖基化修饰物。红细胞膜结构的变化及其导致的红细胞输注效果的改变，已在红细胞体外保存试验中被证实。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）发生以来，全球感染数量不断上升。有患者需要输血治疗时，需进行血型鉴定与配血，为保护工作人员安全，血样灭活是必需流程。目前对于体液等液体类样本采用56℃水浴30分钟的方法。在相关研究中，37℃～42℃水浴作为红细胞老化的经典方法，已被广泛采用，其对红细胞膜结构的破坏亦被细胞学试验所证实， 因此56℃水浴灭活势必对红细胞膜结构有破坏作用。

在灭活后，血样出现明显溶血现象，使得分离后的血浆呈现暗红色，一方面会导致对结果判读产生干扰，另一方面也会导致造成溶血现象的抗体无法被检出[6，7]，干扰抗筛试验。

在红细胞抗原检测方面，本研究选择了对临床输血最为关键的ABO血型系统A、B抗原（糖链抗原），Rh血型系统RhD抗原（多穿膜蛋白抗原）作为主要研究对象，同时还对被证实为保存稳定性最差的Duffy系统Fya抗原（糖基化蛋白）进行了检测。通过本研究发现，在灵敏度较高的血清学试验中，灭活程序将导致红细胞抗原性下降，RhD抗原下降程度高于A、B抗原。这可能的原因是：首先，RhD抗原的抗原本质是蛋白质空间构象，因而抗体识别时对抗原空间结构要求较为苛刻，这一点在D变异型中亦得到证实[8-10]； A、B抗原的识别主要在于糖链基团的识别[11]，而对蛋白空间结构依赖较少，故并未发生如RhD般显著变化。Duffy血型系统抗原被研究证实是保存期间最易减弱的抗原[11]，在本研究中，56℃灭活亦对Duffy血型系统Fya造成了较大破坏，这也同时说明加热对整个红细胞膜表面蛋白造成较大的破坏。

此外，在本实验中还发现，在A、B抗原检测中，灭活样本出现凝集略微增强的现象（图4A、图4B），但并不具有统计学意义，我们推测其可能的原因是，如图3所示灭活后，细胞形态及膜电位的改变造成细胞通过凝胶卡时的动力学因素改变，并且由于糖链热稳定性优于蛋白质，故其并未出现RhD抗原检测中的明显凝集强度下降，却表现出略微增强的试验现象。

综合本实验结果说明，热灭活对红细胞血型抗原有一定的破坏作用，样本溶血后，血浆样本对抗筛试验产生干扰，红细胞膜蛋白空间结构被破坏，造成试剂对抗原检测灵敏度下降，说明该灭活手段不利于血型鉴定及配血试验的进行。

由于亚型或变异型造成弱抗原样本较难获得，本研究中并未使用弱抗原红细胞进行实验。从目前实验结果分析，虽然56℃灭活程序对正常抗原表达的红细胞抗原产生一定破坏作用， 但并未对红细胞抗原的阴性/阳性结果判读产生影响，但实验中观察到灭活过程使凝集强度明显下降，故我们推测对弱表达的红细胞血型抗原产生的影响应更大，可能会直接造成抗原无法检出，影响实验判读。

此外，本研究观察到56℃对红细胞膜蛋白的破坏作用，理论上亦会对血浆中的抗体产生破坏作用，

虽然本研究并未对该内容进行深入研究，但提示在临床样本抗体检测鉴定工作中，应对该问题进行考虑，

并进行留样及相关实验。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突