二次重度离心制备法对冷沉淀凝血因子质量的影响*

余凤秀 李津杞 朱燕霞 郭菲 周载鑫 顾海慧 钱宝华

冷沉淀凝血因子是采用特定的方法将保存期内的新鲜冰冻血浆（FFP）在1～6℃封闭状态融化后，分离出大部分血浆，剩余的冷不溶解物质在1 h内冻结而制成的成分血[1]。其主要成分包括凝血因子Ⅷ（FⅧ）、纤维蛋白原（FIB）、血管性血友病因子（vWF）、凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）以及纤维连接蛋白（Fn）[2]。输注冷沉淀凝血因子是临床预防和治疗出凝血功能异常的有效方法之一，适用于纤维蛋白原缺乏症、甲型血友病、血管性假性血友病、大手术及大出血患者等。依据2012版《全血及成分血质量要求》，冷沉淀中FⅧ含量≥40 IU/200 mL全血新鲜冰冻血浆制备，FIB含量≥75 mg/200 mL全血新鲜冰冻血浆制备[1]。FⅧ是一种不稳定的凝血因子，确保FⅧ活性，本研究实验探讨新鲜冰冻血浆中残留红细胞含量对冷沉淀凝血因子中FⅧ的影响。通过比较一次和二次重度离心新鲜冰冻血浆方法制备的冷沉淀凝血因子中残留血红蛋白含量，观察到游离血红蛋白含量可直接影响冷沉淀凝血因子FⅧ含量，从而影响冷沉淀凝血因子的质量。现将两种方法制备的冷沉淀凝血因子质量的比较报告如下。

材料与方法

1 仪器与试剂

1.1 仪器：大容量离心机（美国Scientific）；低温KJX-Ⅲ型冰冻血浆解冻箱（苏州）；CA-550全自动血凝仪（日本希斯美康）; 756MC紫外分光光量仪（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 试剂 泛Ⅷ因子活性测定试剂盒（批号：548582）；缓冲液（批号：548006）；CaCl2（批号：538970）；纤维蛋白原测定试剂盒（批号：537257）。以上试剂均由日本希斯美康公司提供，且均在有效期内使用。

2 方法

2.1 制备新鲜冰冻血浆：一共采集40袋全血（采集时间＜7 min），每袋200 mL，采集过程按《血站技术操作规程》2019版[3]执行，6 h内于4℃一次重度离心（4 834 g）15 min，手工分离取上层135 mL新鲜冰冻血浆。随机分实验组、对照组，每组20袋。实验组于4 ℃再次重度离心（2 626 g）10 min，手工分离上层血浆，用于制备新鲜冰冻血浆。实验组、对照组新鲜冰冻血浆同时放入–80℃深低温冰箱速冻，并在–80℃条件下储存14天后用以制备冷沉淀凝血因子。

2.2 制备冷沉淀凝血因子：14天后，将实验组、对照组新鲜冰冻血浆同时取出，置（4±2）℃冰箱中过夜融化，以2 800 g，4℃，离心10 min。分出上层血浆100 mL（±10 mL），剩余25～30 mL血浆与白色沉淀物混合，立即置于–50℃速冻，制备冷沉淀凝血因子，1 h后移至–20℃冰箱保存。

2.3 凝血因子的质量控制：将实验组、对照组同时置37 ℃水浴箱中融化，时间不超过10 min，完全溶解后取样，30分钟内完成检测。

2.4 游离血红蛋白的检测：紫外可分光光度仪（型号：N4S）检测游离血红蛋白的含量：用血红蛋白分子中亚铁血红素具有类过氧化酶活物，催化H2O2释放活性氧，使酚以及4-AAP氧化生成红色物体，颜色深浅与Hb含量成正比。所有操作严格遵守仪器、试剂说明书。

2.5 FⅧ和FIB含量测定：CA-550全自动血凝仪（日本希斯美康）检测FⅧ和FIB含量，所有操作均严格遵守仪器、试剂说明书执行。

3 统计学处理 应用SPSS17.0软件，计量资料采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 两种方法制备的冷沉淀中游离血红蛋白含量对比实验组游离血红蛋白含量明显低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2 两种方法制备的冷沉淀凝血因子中FⅧ和FIB含量对比 实验组FⅧ含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。FIB含量无显著性差异，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两种方法制备的冷沉淀凝血因子中游离血红蛋白和凝血因子含量比较

3 冷沉淀凝血因子制品合格率对比 FIB含量均达到国家标准；FⅧ含量合格率对照组低于实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）,参照《全血及成分血质量要求》，质量控制标准：每100 mL新鲜冰冻血浆制备冷沉淀凝血因子FⅧ≥40 IU/单位、FIB≥75 mg/单位为合格，见表2。

表2 两种方法制备冷沉淀凝血因子的合格率比较

讨 论

冷沉淀凝血因子主要成分为FⅧ、FIB、Fn、vWF，具有止血、促进组织修复的作用。在临床实践中，冷沉淀凝血因子主要用于治疗FⅧ因子缺乏所导致的凝血功能障碍，如甲型血友病等。同时在主动脉夹层等出血较多的手术中以及急性大量失血时，可以起到良好的止血功能[4]。《全血及成分血质量要求》（GBl8469-2012）对冷沉淀凝血因子FⅧ与FIB含量有明确要求：来源于200 mL全血的冷沉淀凝血因子中FⅧ含量（IU）≥40 IU，FIB含量≥75 mg[1]。因此，FⅧ和FIB实际含量既是冷沉淀凝血因子的关键质量控制指标也是实际疗效的保证。为提高临床输注疗效，制备过程中应最大限度地保留FⅧ和FIB。《血站技术操作规程》2019版要求制备过程中，尽量去除红细胞[3]，研究表明，在新鲜冰冻血浆冷冻时可使残留的红细胞破裂，从而激活促凝血系统，影响Ⅷ因子的稳定性[5，6]，因此冷沉淀原料血浆袋内应尽量减少残留红细胞成分。本研究中发现，游离血红蛋白含量与冷沉淀中FⅧ含量成负相关。

冷沉淀凝血因子制备方法包括离心法和虹吸法，研究表明，虹吸法通过晃动水浴箱达到加速融化的目的，容易将析出的沉淀物质晃散，造成成品效价低[7]。离心法将解冻的新鲜冰冻血浆经4 ℃条件下重度离心后，不溶物质沉淀在血袋底部，提高回收率。但实际操作中发现一次重离新鲜冰冻血浆（冷沉淀凝血因子原料浆）制备的冷沉淀凝血因子上清液易呈现淡红色，经检测游离血红蛋白含量增加，FⅧ含量低于规定标准，产品合格率降低。因此本实验在制备新鲜冰冻血浆的一次离心法的基础上，通过增加一次重度离心，减少红细胞残留，从而减少冷沉淀凝血因子游离血红蛋白含量，以提高冷沉淀凝血因子的质量。经检测，实验组冷沉淀凝血因子中的游离血红蛋白含量低于对照组，FⅧ含量和合格率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而FIB含量两组均达到国家质量标准，合格率均为100%，差异无统计学意义（P＞0.05)。结果表明冷沉淀凝血因子中游离血红蛋白含量与FⅧ含量呈负相关，FIB含量不受影响。目前，二次离心新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)制备的冷沉淀凝血因子，增加一次2 626 g，4℃，10 min，离心制备新鲜冰冻血浆(冷沉淀凝血因子原料浆)，最大程度去除残留红细胞，降低新鲜冰冻血浆（冷沉淀凝血因子原料浆）血红蛋白含量，对提高冷沉淀凝血因子中FⅧ含量具有积极的指导意义。

冷沉淀凝血因子中的FⅧ活性极不稳定，半衰期只有8～12 h，而且受献血者自身凝血因子质量、血液采集、制备及运输等诸多因素影响。如选择专业的全自动冷沉淀凝血因子制备设备和缩短速冻时间可明显提高FⅧ活性[8-11]。据报道，全血采集后22 ℃、6 h内离心制备新鲜冰冻血浆，FⅧ活性几乎无差异，但随着时间延长，超过24 h制备的新鲜冰冻血浆，FⅧ活性下降30%[12]。本实验均在全血采集后6 h内，离心制备新鲜冰冻血浆，两组冷沉淀凝血因子外观均为黄色澄清液体，无色泽异常、蛋白析出、气泡及重度乳糜等情况。此外，两组合格率均符合《血站技术操作规程》质量控制要求的75%合格率。说明二次重度离心法不仅符合临床输注的冷沉淀凝血因子标准要求，同时可提高冷沉淀凝血因子的质量。因此，采用二次重度离心新鲜冰冻血浆（冷沉淀原料浆）制备冷沉淀凝血因子是可行的。

综上所述，根据《血站技术操作规程》一次重度离心，目测残留红细胞较少即可制备成新鲜冰冻血浆[3]。而本文中通过二次重度离心，可以最大程度去除新鲜冰冻血浆中残留的红细胞，可提高单位体积内FⅧ的含量，减少患者冷沉淀凝血因子输注总量，降低输血反应发生风险，提高临床输血疗效。二次重度离心法对冷沉淀凝血因子质量更有保障，对血液成分制备工作有重要指导意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突