煤矸石及其自燃风化土中可培养细菌的分离与解磷抗镉特性

姜彬慧， 姜 琦， 周星星， 施 洋

(东北大学 资源与土木工程学院， 辽宁 沈阳 110819)

煤矸石是夹杂在煤系地层中与煤系地层共生的岩石，在煤炭开采和洗选过程中产生的固体废弃物约占煤炭总产量的10%～15%，是目前我国排放量最大的固体废弃物之一.预计到2020年，中国的煤矸石总产量将达到7.29亿t[1].大量煤矸石的堆积会严重破坏生态环境，损害人类身体健康.煤矸石主要由碳质页岩、泥质页岩、砂质页岩、煤炭及砂岩等沉积岩组成，发热量为4.19～12.6 MJ/kg.由于各种因素的影响，长期堆积的煤矸石会发生氧化，从而导致整体温度超过1 000 ℃而发生自燃.在煤矸石自燃过程中，有机物和矿物质都会发生氧化和热变化，产生的有毒有害气体导致大气和水体污染，是每个煤炭生产和消费大国必须面临的又一重大问题[2].目前煤矸石堆积产生的一系列环境问题已经成为当前资源开采引发的环境热点问题[3-4]，因此，对煤矸石山的治理刻不容缓.

由于煤矸石风化土的结构性差，保水保肥的能力较低，缺乏植被生长所需的营养物质[5].复垦时的土壤比较贫瘠，植物生长缓慢，需要补充大量客土，成本高，生态恢复周期长等制约矸石山的生态恢复进程，而土壤的养分状况与煤矸石山生态系统的演替及生态恢复息息相关.为了提高植物生长速度，加快矸石山的生态恢复，提高土壤的有效磷含量是行之有效的方法之一.磷是植物生长发育必需的营养元素之一，植物吸收的磷主要来自土壤，而土壤中绝大部分的磷是以植物难以直接吸收利用的无效磷形式存在[6].此外，当土壤中含有较高浓度的重金属(如Cd)时，通过抑制植物生长过程中对土壤中铁的吸收，使土壤中的铁氧化物会和有机酸及磷形成络合物，增加磷的沉积，进而导致磷的缺乏[7-8].解磷细菌(phosphate solubilizing bacteria，PSB)不仅能够有效地将土壤中无效的磷素转化为植物可利用态，而且还能够促进植物对Cd污染土壤的修复.Boggess等[9]研究表明在低磷的条件下，土壤中的Cd会显著降低植物的生长量，而向土壤中添加磷的刺激，能够增加植物干重，降低Cd的毒性.Jeong等[10]研究表明，巨大芽孢杆菌作为PSB，能够促进土壤可溶性磷的释放，增加污染土壤中Cd的生物利用度，提高植物对Cd的吸收能力.Li等[11]的研究也证明了PSB能够通过分泌有机酸，促进污染土壤中Cd的迁移能力及Cd的生物修复.目前，许多学者已经筛选出具有解磷能力的细菌及真菌等微生物，芽孢杆菌属和假单胞菌属等都是有效的磷酸盐增溶菌剂，通过产生有机酸，溶解不溶性磷酸盐是PSB的解磷机理[9,12].本文首次从抚顺西露天煤矿内排土场堆积的煤矸石及煤矸石自燃风化土中分离得到3株细菌，在对菌株进行分类鉴定、生理生化特征分析的基础上，进一步考察了菌株的解磷能力及对重金属Cd的抗性，为抗重金属生物磷肥的研制提供理论依据和技术支持.

1 材料及方法

1.1 材 料

1) 土样:2018年10月采集于辽宁抚顺西露天矿区南部千台山排土场堆积的煤矸石风化土(MF)及煤矸石自燃风化土(MZ)，经除杂、破碎、研磨，过0.841 mm筛备用.MF和MZ的养分及重金属Cd含量[13]见表1.

表1 煤矸石风化土及煤矸石自燃风化土养分的质量分数及重金属Cd的质量比

2) 培养基:牛肉膏蛋白胨培养基包括牛肉膏5.00 g，蛋白胨10.00 g，氯化钠5.00 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4；无机磷液体培养基包括葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO47H2O 0.1 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母膏 0.5 g，FeSO47H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5.

1.2 菌种的分离、纯化及分类鉴定

称取10 g经过处理的土样，分别加入90.0 mL去离子水，于160 r/min，30 ℃下振荡24 h，取上清液，将每个样品稀释100～10 000倍，制成菌悬液，于牛肉膏蛋白胨固体培养基上涂布，培养24 h.观察菌落形态，挑取不同形态菌落进行平板划线，分离纯化至少2代以上，保存于4 ℃冰箱备用.

采用革兰氏、芽孢及荚膜染色，利用光学显微镜观察菌体形态；利用PCR仪进行16S rRNA基因测序，将得到的序列结果在NCBI的网站上进行比对，并用软件MEGA构建系统发育树；利用API20E(Bio-Merieux)试剂盒及GP2 鉴定板(Biolog) (方法参照公司说明书)检测菌株的生理生化特性.

1.3 细菌溶磷量的测定

将纯化后的细菌利用牛肉膏蛋白胨培养基培养18 h，制成菌悬液，将体积分数为1%的菌悬液(OD600为1.0～1.4)加入到100/250 mL无机磷培养基中，在120 r/min，30 ℃的条件下连续振荡培养6 d，每24 h取样一次.取出的样品经10 000 r/min，4 ℃离心5 min，吸取上清液1.5 mL，通过钼锑抗比色法测定并计算原始溶液中有效磷的浓度.

1.4 细菌对Cd2+的耐受性检测

在含有Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养基中，逐步提高Cd2+的质量浓度(5，10，20，30，50和100 mg/L)，对已分离纯化出的菌株进行梯度驯化培养，观察菌株的生长状况，确定其对Cd2+的最大耐受剂量.

2 结果与讨论

2.1 细菌的分离纯化及种属分类鉴定

1) 菌株的形态学特征及16S rRNA基因序列分析:从煤矸石自燃及风化土壤中分离出3株细菌，细胞的形态、大小及菌落特征如图1所示.

采用细菌通用引物测定菌株MZ1，MZ2和MF2的16S rRNA 基因序列，得到的目标序列长度分别为1 467，1 500和1 335 bp.用得到的序列在GenBank 数据库中进行Blasten 检索，结果表明菌株MZ1与Acinetobacterradioresistens，MZ2与Bacillusparamycoides及MF2与Paenarthrobactersp.序列同源性分别达到100 %，99.93 %和100%. 采用软件MEGA4.1中的Neighbor-joining 法构建菌株16S rRNA序列系统发育树，如图2所示.

菌株MZ1为抗辐射不动杆菌(A.radioresistens)，由煤矸石自燃风化土中分离，菌株为多形球菌，细胞壁较厚且光滑，常成对出现，(0.8～1.2) μm × 0.6 μm；菌落圆形、米白色、不透明，边缘光滑，革兰氏阴性，无芽孢，无运动性，好氧，不能发酵，可利用糖类但不产酸.

Ngaiganam等[16]从法国马赛鸡和黄腿鸥中分离出3株抗辐射不动杆菌，经药敏试验结果表明，3种分离菌株对替卡西林和厄他培南等抗菌素均具有抗药性.Hong等[17]从废水中分离1株抗辐射不动杆菌(A.radioresistensCMC-1)，该菌能在碱性环境(pH 7.0～11.5)生长，最适生在pH 7.5和30 ℃.该菌株可以利用三油酰甘油酯、对硝基苯酚酯、正十六烷和吐温80为底物生产碱性脂肪酶ARL[17-18].另外，抗辐射不动杆菌具有较强的抗旱性，能够在31%的相对湿度(RH)下平均存活157 d[19].

菌株MZ2为拟蕈状芽孢杆菌(B.paramycoides)，由煤矸石自燃风化土中分离，菌株呈长杆状，(2～3.5) μm ×(1～1.5) μm；菌落呈较扁平的根状、米白色、不透明，边缘不整齐.革兰氏阳性、有芽孢、无荚膜.

拟蕈状芽孢杆菌(Bacillusparamycoides)是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌，能够形成菌丝菌落，具有较厚的肽聚糖壁[20].Saran等[21]首次报道了拟蕈状芽孢杆菌(B.paramycoides)ST9在含有重金属Pb和Cd污染的土壤中，具有促进植物生长的作用.在不抑制植物生长的情况下，与对照组相比，菌株ST9对铅和镉的生物累积因子(BAF)分别增加了3倍和6倍.

菌株MF2为Paenarthrobactersp.微生物，由煤矸石风化土中分离，菌株短杆状，(0.5～1.8) μm× 0.3 μm；菌落呈圆形、浅黄色、不透明，边缘光滑，革兰氏阳性.

Paenarthrobactersp. 因细胞壁中肽聚糖组成与极性脂类型的不同，1992年由Busse等[22]将其从节杆菌属划分出来，模式种为Paenarthrobacteraurescens.，目前有6个种.Cao等[23]从活性污泥反应器中分离纯化出一株Paenarthrobactersp.A01细菌，该菌株对微污染物磺胺二甲嘧啶(SMZ)具有较强的降解作用，可将约90.7%的SMZ转化为2-氨基-4，6-二甲基嘧啶.此外，负责磺胺类药物分解的sad基因在A01中具有96.0%～100.0%的高度相似性.

2) 菌株的生理生化特性:3株细菌对碳源和氮源利用及酶活性特征见表2.可知1%乳酸钠、丁酸钠及α-酮戊二酸(微弱)是3株细菌可以共同利用的碳源，亚硝酸钾为共同利用的氮源.

表2 3株细菌对碳源和氮源的利用能力及酶活性特征

与其他2个菌株相比，抗辐射不动杆菌MZ1能够利用的碳源种类不多，主要有L-乳酸、乙酸、γ-氨基丁酸、β-羟基-D,L-丁酸和丙酮酸甲酯等小分子有机酸或酯.对糖及其衍生物如D/L-岩藻糖、D-果糖-6-磷酸、D-葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酰胺、糊精、明胶和果胶有微弱的利用能力.但具有分解利福霉素SV、林可霉素、万古霉素、吐温40、十四烷基硫酸钠和四唑蓝的酶.还能利用D-丝氨酸、L-精氨酸作为氮源.

拟蕈状芽孢杆菌MZ2能耐受8%的NaCl，具有盐酸胍、氨曲南和利福霉素SV的水解酶，对二甲胺四环素、萘啶酸和四唑紫等抗菌素有一定的分解能力.主要以多糖(糊精、果胶和明胶)、二糖(D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、蔗糖)和单糖(a-D-葡萄糖、D-果糖以N-乙酰-D-葡糖胺及D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸)作为碳源和能源，也能利用小分子有机物如甘油、1% 乳酸钠、L-乳酸、柠檬酸、甲酸、丁酸钠作为碳源.利用L-丝氨酸和D-丝氨酸作为氮源，此外该菌株还能利用氯化锂、亚碲酸钾等无机盐作为微量元素来源.

Paenarthrobactersp.MF2利用糖类作为碳源方面与拟蕈状芽孢杆菌MZ2相似，但可利用的糖类比MZ2更多一些(如龙胆二糖、D-棉子糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酰胺等).MF2能利用乙酸、乙酰乙酸、萘啶酸、奎宁酸等小分子有机酸作为碳源.对氨基酸的利用能力较差，只能微弱利用D-丝氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸作氮源.MF2和MZ2含有的抗生素分解酶有差异.MF2还能利用盐酸胍、氨曲南、四唑紫和吐温40等物质.

2.2 菌株解磷能力研究

许多学者报道了解磷细菌主要的代表是芽孢杆菌属、欧文氏菌属、假单孢菌属、黄杆菌属、土壤杆菌属、沙雷氏菌属及微球菌属等微生物.本研究首次发现Paenarthrobactersp.属菌株也具有较强的解磷能力.由图3可知，3株细菌的解磷能力由高到低依次为Paenarthrobactersp. MF2>拟蕈状芽孢杆菌MZ2>抗辐射不动杆菌MZ1.与对照组(CK)相比，MF2溶出磷的质量浓度在第 72 h 达到最高，为71.76 mg·L-1，MZ2溶出磷的质量浓度在96 h达到最高，为55.48 mg·L-1.刚接种的MZ1几乎不具有解磷能力，培养至120 h，有微弱的磷溶出，其质量浓度仅为5.79 mg·L-1.随着时间的增加，MF2及MZ2发酵液中可溶性磷的质量浓度均呈现先升高后降低的趋势.

不同培养时间各组菌株解磷过程中pH的变化如图4所示，随着菌株的生长，对营养物底物的代谢速度加快，酸性代谢产物(有机酸)迅速增加，发酵液中的pH逐渐降低.其中对照组(CK)的pH基本保持在7.5左右；MF2和MZ2的代谢速度较快，在24 h以内就产生大量有机酸，所以发酵液中pH很快下降到6以下.

由菌株发酵过程中溶液的pH与可溶性磷的质量浓度的Pearson相关性分析(图5)可知，发酵液的pH与可溶性磷的质量浓度在0.01水平上呈显著的负相关性.说明菌株代谢产生的有机酸有助于难溶性磷酸盐的溶解，该结论与Rezakhani等[12]的研究结果相符.MZ1在培养24～72 h后，发酵液中的pH一直在7.5以上，直至100～120 h时，pH才下降到6左右，出现微弱的解磷现象.由于抗辐射不动杆菌为好氧菌，利用碳源时不产生酸，所以开始时几乎没有解磷作用.推测在120 h时产生微弱的解磷能力，是由于MZ1在好氧条件下代谢产生的CO2与水形成的碳酸所致.抗辐射不动杆菌细胞壁较厚且光滑，对抗菌素和干旱有较强的抗性[19]，同时具有耐酸的特征，能够高效降解硫酸盐，有较强的还原硫酸盐的能力，因此可以在营养贫瘠并且含硫量较高的煤矸石自燃风化土中生存.

2.3 菌株对Cd的耐受性研究

1) 耐受细菌的筛选及最大耐受剂量:利用Cd2+的质量浓度分别为5，10，20，30，50和100 mg·L-1的牛肉膏蛋白胨培养基，依次递增驯化培养菌株，考察上述3种细菌对重金属Cd2+的耐受性，确定它们对Cd2+的最大耐受能力.实验结果显示:从煤矸石自燃风化土中分离出的2株细菌MZ1和MZ2对重金属Cd2+具有较大的耐受性，当Cd2+的质量浓度大于10 mg·L-1时，对MF2有明显的抑制作用，但对MZ1和MZ2的生长会有少许的促进作用；当Cd2+的质量浓度为10～50 mg·L-1时，菌株MZ1和MZ2的生长随着Cd2+浓度逐渐增加而受到抑制；当Cd2+的质量浓度大于50 mg·L-1时，菌株MZ1不生长；当Cd2+的质量浓度为100 mg/L时，菌株MZ2虽然有少量生长，但延缓期延长.据此判断菌株MF2，MZ1和MZ2对重金属Cd2+的最大耐受质量浓度分别为10，50和100 mg·L-1.拟蕈状芽孢杆菌MZ2具有明显的芽孢(图1 b)，能耐受8%的NaCl，具有盐酸胍、氨曲南和利福霉素 SV的水解酶，对醋竹桃霉素、二甲胺四环素、萘啶酸和四唑紫等抗菌素有一定的抗性(表2).Turchi等和Cao等均报道了拟蕈状芽孢杆菌是抗重金属Pb和Cd的植物生长促进剂，在重金属污染的环境下，通过诱导菌体细胞对不良环境因子的胁迫产生多种生理、形态的响应，获得适应性生存机制[20,23].文献[24-25]的研究表明:相比于无重金属污染的区域，重金属污染场地分离出的细菌具有显著的重金属抗性.由表1可知， MZ和MF中重金属Cd的质量比均超过了抚顺地区土壤背景值(0.074 mg·kg-1)，细菌长期处于Cd污染的环境中，会对Cd产生一定的耐受性.MZ中Cd的质量比(2.80 mg·kg-1)明显高于MF中Cd的质量比(1.10 mg·kg-1)，从MZ中分离出的细菌与从MF中分离的相比，菌株MZ1和MZ2对Cd均具有较高的耐受性.煤矸石风化土及自燃风化土中均含有较为丰富的有机质和氮元素(见表1)，为微生物的生长提供了一定的营养环境，但风化土中有效磷含量较少[13]，菌株MZ2和MF2具有一定的解磷能力，能够将土壤中的难溶性磷转化为有效磷，并通过自身的代谢活动改良土质，增强土壤肥力，为植物生长提供可能.

3 结 论

1)Paenarthrobactersp. 属菌株MF2具有较高的解磷能力，对磷酸钙的溶解能力在72 h可达71.76 mg·L-1，但是该菌株对重金属Cd2+的耐受性最差，仅为10 mg·L-1；抗辐射不动杆菌MZ1对Cd2+有较高的耐受性(50 mg·L-1)，但解磷能力最弱(120 h，5.79 mg·L-1)；拟蕈状芽孢杆菌MZ2有较强的解磷能力(96 h，55.48 mg·L-1)，对Cd2+有很大的耐受性(100 mg·L-1)，具有开发成为重金属抗性微生物磷肥的潜力.在污染土壤环境中，后续将深入研究重金属胁迫下的细菌解磷作用机理，以期用于解决利用植物修复重金属Cd污染土壤时所面临的磷素缺乏问题.

2) 菌株MF2和MZ2的解磷机理主要是通过代谢产生的有机酸对不溶性磷酸盐的溶解作用，可将产酸菌作为土壤的生物修复剂，耐受重金属的产酸菌用于强化重金属污染场地的生态修复，不耐受重金属的产酸菌用于强化未受重金属污染但磷缺乏土地的生态修复.