阿司匹林主要代谢物的毛细管电泳安培检测研究

2020-10-18张基木

广州化工 2020年19期

张基木

(中化地质矿山总局福建地质勘查院，福建福州 350011)

乙酰水杨酸(Acetylsalicylic acid)又称阿司匹林(Aspirin)是医药史上三大经典药物之一，用于临床已有100多年，至今仍然是世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药。近年来发现阿司匹林在体内具有抗血栓的作用，它能抑制血小板的聚集，在临床上可用于预防心脑血管疾病的发作，为该药开辟了新的应用领域[1-2]。

口服阿司匹林后,它在肝脏或者血浆中伪胆碱酯酶的催化下迅速水解成水杨酸(Salicylic acid)，作为阿司匹林的主要活性代谢物，其主要代谢途径有：生成甘氨酸结合物水杨尿酸(Salicyluric acid)，羟基化产物龙胆酸(Gentisic acid)和2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)，还有一部分是生成葡糖苷酸的结合物。其中水杨酸、水杨尿酸、龙胆酸和2,3-二羟基苯甲酸其结构(见图1)均含有酚羟基，具有电化学活性，能够用电化学检测器来检测。

图1 水杨酸及其三种主要代谢物结构图Fig.1 Structural diagram of salicylic acid and its three main metabolites

目前已报道的有关体液中阿司匹林和代谢物的分离方法主要有高效液相色谱法、高效毛细管电泳和气相色谱等几种，常用检测方法有紫外检测法、荧光检测法和质谱法等。为了研究水杨酸和它的代谢物在动物中的排泄方式，S.Croubels等[3]开发了一种液相色谱与质谱联用技术。S.Zaugg等[4]建立了一种毛细管电泳与激光诱导荧光联用方法对尿液中阿司匹林的主要代谢物(水杨酸、龙胆酸、水杨尿酸)进行分离测定。与上述方法相比，毛细管电泳电化学检测具有样品处理简单，成本低廉等优点，因此本文拟应用毛细管电泳-安培检测联用技术建立一种灵敏度高、快速的阿司匹林代谢物分离检测方法，以期应用于体液分析。

1 实验

1.1 仪器与试剂

实验室自组装的毛细管电泳-安培检测装置(组件包括：±30 kV/0.3 mA 无极可调高压电源)，上海原子核研究所；未涂层石英毛细管(φ25 μm×60 cm)，河北永年光纤厂；三电极工作系统；BAS LC-4C型安培检测器(Bioanalytical System, West Lafayetle, In, USA)、HW-2000色谱工作站,南京千谱软件有限公司；CHI 660A 电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统，Millipore，Bedford，USA；PHS-2C型精密酸度计，上海雷磁仪器厂；KQ-100型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

水杨酸(Salicylic acid，SA)、龙胆酸(Gentisic acid，GA)、和2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)均购自百灵威；水杨尿酸(Salicyluric acid，SU)由Sigma公司购得。试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 电泳条件

未使用过的毛细管先用1 mol/L的NaOH溶液活化2 h，再用Milli-Q超纯水冲洗30 min。每日试验前，毛细管用0.1 mol L-1的NaOH洗10 min、水洗10 min、缓冲液洗5 min以保证迁移时间的重现性。缓冲液和样品溶液在测定前需用0.22 μm滤膜过滤，并用超声仪除气泡。

分离条件：40 mmol·L-1pH 9.2硼酸-硼砂缓冲液为运行缓冲液；电动进样18 kV(12 s)；分离电压18 kV，检测电位+0.95 V，所有实验都在25 ℃室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 循环伏安实验(CV)

从图2我们可以清楚的看到这四种代谢物都有电化学活性，GA和2,3-DHBA的氧化峰电位较低，分别为0.3 V和0.4 V，SU氧化峰电位在0.7～0.8 V之间，SA的氧化电位较高，在0.95 V左右。因此我们初步选定工作电极的电位为0.95 V。

图2 四种代谢物的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammetry of four metabolites

2.2 四种代谢物分离条件的优化

2.2.1 检测电位的优化

在CE-AD中，加在工作电极上的电位直接影响检测的灵敏度和检测限，因此，考察了这四种代谢物在毛细管电泳体系中的流体动力学伏安图。如图3所示，在+0.7～ +1.0 V(vs. Ag/AgCl)范围内考察了不同的检测电位对四种代谢物的响应情况的影响。从图中可以看出，SA在电位为0.70 V时，峰电流几乎为零，电位增加时，峰电流急速升高。GA和2,3-DHBA在0.70～0.85 V范围内随电位升高峰电流迅速增加，到0.9 V时峰电流基本达到最大值，继续增加电位，其峰电流反而下降。SU的峰电流随着电位升高而增加，并在1.0 V时趋于平缓。而且实验过程中发现，在pH=9.2，浓度为40 mM的硼酸-硼砂缓冲液中，检测电位为+0.95 V时基线较平稳，检测器对各待测组分的检测灵敏度均较高，继续提高检测电位，基线电流会急剧上升，致使信噪比下降。综合以上因素，最终选择0.95 V为最佳工作电位。

图3 四种代谢物的流体力学伏安图Fig.3 Voltammetric diagram of four metabolites

2.2.2 缓冲液的影响

(1)缓冲液类型的选择

缓冲液是各种组分运行的载体，缓冲液的类型不仅影响到EOF，而且直接影响到粒子的迁移和组分最后的分离效果。本实验考察了磷酸盐、硼酸盐、Tris-HCl三种缓冲液对分离的影响，结果表明，在硼酸-硼砂缓冲液中四种待测组分的响应最好，分离效果最好，因此我们选择了硼酸-硼砂缓冲体系为最佳电泳运行液。

(2)缓冲液pH值的影响

缓冲液pH的改变，除影响溶质本身的电荷外，还会引起电渗流的相应变化。本文在选定的硼酸-硼砂缓冲体系中，考察了pH在8.0～10.0范围内，对四种代谢物的分离效果的影响。如图4所示，四种代谢物的迁移时间随着pH增大而增加，当pH=8.8时SA跟2,3-DHBA不能分开，随着pH值的提高，分离度逐渐得到改善，pH为9.2时达到完全基线分离。但是随着pH值再增加GA与SA逐渐靠近，不能达到基线分离。综合考虑到峰形、分离度等原因，实验选择pH 9.2作为最佳pH值。

图4 缓冲液pH对四种代谢物分离的影响Fig.4 Effect of buffer pH on separation of four metabolites

(3)缓冲液浓度的影响

缓冲液浓度增大，缓冲介质的离子强度随之增加，双电层的Zeta电势减小，电渗流速降低，分离度得到改善，迁移时间延长。但是较高浓度的缓冲液常常会导致很高的管电流，产生大量焦耳热，使得基线升高，灵敏度降低，而浓度太低，则起不了缓冲液的缓冲作用。本文考察了硼酸-硼砂缓冲液浓度分别为10、20、30、40、50 mM时，浓度对迁移时间及峰电流的影响。从图5可以看出，当浓度低于10 mM时SA和2,3-DHBA不能基线分离，随着浓度增加，分离度提高，迁移时间变长。当浓度大于40 mM时，背景电流明显增大，基线噪音上升，GA和2,3-DHBA峰电流降低(见图6)，峰形展宽。综合分析时间、峰电流等因素，实验选择40 mM硼酸-硼砂缓冲液(pH 9.2)为运行缓冲液。

图5 缓冲液浓度对迁移时间的影响Fig.5 Effect of buffer concentration on migration time

图6 缓冲液浓度对峰电流的影响Fig.6 Effect of buffer concentration on peak current

2.2.3 分离电压和进样时间的选择

分离电压的改变主要影响组分的迁移时间和分离效果两方面因素。分离电压越高，样品的迁移时间越短，但分离效果不如电压较低时好，而且电场对工作电极的干扰增大。若分离电压太低，样品的迁移时间过长，峰形也会有所展宽，峰电流降低。本文考察了14～20 kV之间的分离电压对迁移时间的影响，结果(图7)表明在这个范围内四种代谢物均能得到很好基线分离。而且随着分离电压的增加，迁移时间缩短，在一定范围内检测灵敏度也相应增加。但当分离电压大于18 kV时，基线噪音增大，为了保证最佳的分离度和迁移时间，最终选择18 kV为最优分离电压。

图7 分离电压对迁移时间的影响Fig.7 Effect of separation voltage on migration time

在毛细管区带电泳中，进样时间的长短不仅影响进样量的多少，而且在一定程度上也影响着峰形。在18 kV条件下，本实验研究了进样时间分别为6，8，10，12，14 s时的分离情况，测定四种物质的峰高和进样时间的关系(图8),从图中可以看出，峰电流随着进样时间的增加迅速增加，当进样时间超过12 s后峰电流增加不明显，而且引起峰展宽、拖尾等影响。故选择12 s为最优进样时间。

图8 进样时间与峰电流关系图Fig.8 Relationship between injection time and peak current

2.3 阿司匹林四种代谢物的毛细管电泳分离行为

经过一系列影响因素的优化后，在40 mmol/L 硼酸-硼砂运行缓冲液(pH 9.2)中，从毛细管阳极端电动进样18 kV(12 s)，采用分离电压18 kV, 对阿司匹林四种代谢物进行CZE分离。柱端安培检测池为阴极电泳槽，采用三电极系统(碳圆盘电极，Pt对电极，Ag/AgCl参比电极)检测，工作电位+1.0 V(vs.Ag/AgCl)，记录的CZE电泳谱图见图9。