短程分子蒸馏提取滩羊尾脂共轭亚油酸的研究

于洋，冯毅，宋宏立，吴禹昊，逄晓阳，马青，*

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川750002；2.宁夏盐池县农牧局农经站，宁夏盐池751500；3.青岛农业大学海都学院，山东莱阳265200；4.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193）

盐池滩羊是一种独特的绵羊地方品种，主要生长在中国宁夏盐池县。滩羊肉鲜红色，有均匀的脂肪分布、细腻的肉质和不腥不膻的品质，一直被认为是高品质的羊肉代表[1]。近年来，盐池滩羊年饲养量稳定在300万只左右，年出栏滩羊育肥羊达180万只[2]。滩羊尾巴是滩羊的储能器官之一，成年滩羊尾巴的重量约为1.5 kg～2.5 kg，羊尾的主要成分是脂肪[3]，由于其食用价值低，且目前缺乏滩羊尾脂的高值化精深加工技术，导致作为屠宰加工副产物的滩羊尾脂利用率极低，少数用于制作羊肉串和调味品，滩羊尾脂每年都会产生大量堆积，既造成资源浪费又导致环境污染。

研究表明，羊尾脂中含有大量高附加值的脂肪酸，尤其是对人体有益的共轭亚油酸含量十分丰富[4]。共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亚油酸的同分异构体，是一种天然存在于各种生物体内的物质，目前普遍认为亚油酸在反刍动物瘤胃中被异构化酶作用转变为共轭亚油酸，而人体自身不能合成[5]，必须从CLA含量较高的牛、羊等反刍动物或CLA营养补充剂中摄取。现已证实CLA具有抗癌[6]、抗动脉粥样硬化[7]、抗肥胖的功效[8]、同时还具有调节骨密度[9]、增强免疫力[10]、预防糖尿病[11]等功能，是继α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）之后又一种极其重要的功能性脂类物质，是美国食品与药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）承认的食品补充剂。

目前CLA已广泛用于食品[12]、制药[13]和饲料行业[14]。CLA在动物产品和植物产品中普遍存在，并且反刍动物产品中的CLA含量更丰富[15]。国内外学者很早就关注了反刍动物产品中的CLA。杨晶等研究了不同品种不同部位羊肉中CLA的含量，结果表明羊的品种和部位都对羊肉中CLA的含量有一定影响，羊脂肪中的CLA含量显著高于羊肉[16]。薛宝玲等探讨了不同月龄乌珠穆沁羊MyHC基因与脂肪及共轭亚油酸含量的相关性，结果发现乌珠穆沁羊MyHCⅠ基因与MyHCⅡa基因的表达量与脂肪中共轭亚油酸总含量的变化相对一致[17]。

尽管围绕羊脂肪中的CLA已经开展了很多研究[18-20]，但是如何提取利用羊脂肪中的CLA还没有相关报道。本研究对比了不同提取溶剂、不同提取时间、不同提取温度等对羊尾油脂的提取效果，重点研究了短程分子蒸馏技术提取油脂中共轭亚油酸的效果并对最佳提取工艺条件进行优化，建立了羊尾脂中共轭亚油酸的高效提取技术。研究和开发羊尾脂高值化利用技术，可显著提升羊尾脂经济价值，同时减少环境污染，这对于增加农牧民收入，发展绿色畜牧业，实现农业供给侧结构性改革和乡村振兴具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

从宁夏回族自治区盐池县采集滩羊屠宰后的新鲜羊尾样品，编号后迅速放入冷藏保温箱低温冷藏保存，6 h内放到实验室-20℃冰箱冷冻保存。

1.1.2 试剂与仪器

无水Na2SO4（分析纯）、正己烷（色谱纯）、异丙醇（分析纯）、NaOH（分析纯）、CH3OH（分析纯）、氯乙酰（分析纯）、无水CH3OH（分析纯）、石油醚（30℃～60℃，分析纯）、正己烷（分析纯）、环己烷（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；共轭亚油酸标准品：美国Sigma公司。

BSA124S-CW电子天平：德国Sartorius公司；MJWBL1022S破壁料理机：美的集团有限公司；MVS-1涡旋混合器：北京金北徳工贸有限公司；SC-5A水浴锅：宁波新芝科技有限公司；Agilent HP-88色谱柱、7890B Agilent气相色谱仪：美国Agilent公司；3K-15高速冷冻离心机：美国Sigma公司；KDL-5短程分子蒸馏仪（蒸发面积5 dm2）：德国UIC公司。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液制备

氢氧化钠甲醇溶液：称取2.0g氢氧化钠溶于100mL无水甲醇中，混合均匀，其浓度为20 g/L，现用现配；200 mL/L盐酸甲醇溶液：取10 mL氯乙酰[CH3COCl]缓慢注入盛有100 mL无水甲醇的250 mL锥形瓶中，混合均匀，现用现配；硫酸钠溶液：称取6.67 g无水硫酸钠溶于100 mL水中，其浓度为66.7 g/L；异丙醇正己烷混合液：将异丙醇和正己烷（2∶3，体积比）混合均匀；共轭亚油酸（CLA）标准溶液：称取c9，t11共轭亚油酸甲酯10.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，正己烷溶液溶解并定容至刻度，终浓度为95.2 μg/mL。

1.2.2 试样处理

将样品切成约1 cm3的方块，浸入液氮中进行速冻，待肉块变为白色放入破壁料理机中进行粉碎直至变为末状。称取5 g～10 g，准确至0.01 g，置于蒸发皿中，蒸出水分，取出装入滤纸筒内。

1.2.3 不同有机溶剂抽提脂肪效率比较

将滤纸筒放入索氏抽提的抽提筒内，连接已干燥至恒重的接收瓶，分别由抽提器冷凝管上端加入无水乙醇、环己烷、正己烷、石油醚至容器容积2/3处（70 mL），于加热套加热，使无水乙醇、环己烷、正己烷、石油醚不断回流抽提（6次/h～8次/h），一般抽提 6 h～10 h。提取结束时，用磨砂玻璃棒接取1滴提取液，磨砂玻璃棒上无油斑表明提取完毕[21-22]。

取下接收瓶，回收无水乙醇、环己烷、正己烷、石油醚，加入适量无水硫酸钠脱水后，在连有真空泵的旋转蒸发器中以40℃水浴温度进行旋转蒸发，浓缩得到粗脂肪，并重复步骤至恒重。

试样中脂肪的含量按下式计算：

式中：X为试样中脂肪的含量，%；m1为恒重后连接接收瓶和脂肪的含量，g；m0为接收瓶的质量，g；m2为试样的质量，g。

1.2.4 单因素试验

以石油醚为提取溶剂，在60℃的温度、料液比为1 ∶30（g/mL）的条件下，比较不同提取时间（6、7、8、9、10 h）对粗脂肪提取率的影响；以石油醚为提取溶剂，在提取时间为6 h、料液比为1∶30（g/mL）的条件下，比较不同提取温度（40、50、60、70、80 ℃）对粗脂肪提取率的影响；以石油醚为提取溶剂，在提取温度为60℃，提取时间为6 h的条件下，比较不同料液比[1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]对粗脂肪提取率的影响。

1.2.5 响应面试验

分别选取抽提时间、温度、料液比，设计三因素三水平响应面试验，见表1，通过检测脂肪提取率衡量试验效果。

表1 响应面试验的因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface test

1.2.6 短程分子蒸馏提取CLA

将抽提的羊尾脂肪于60℃水浴恒温至完全融化，利用短程分子蒸馏仪进行分子蒸馏，蒸馏温度分别设定为 250、270、290、300、305、310、315、320、325、330、335 ℃。进料温度为40℃；操作真空度为1 mbar，刮板转速为378 r/min。同时在每一次变化蒸馏的温度，实施短程分子蒸馏前，用无水乙醇、石油醚把设备洗净。使设备内壁的乙醇与石油醚自然挥发，以免污染分馏的产物。将所得的分子蒸馏轻相和重相分馏物分装，冷却后称重，计算轻相分馏物得率，于4℃条件下储存备用。

采用具有100%聚甲基硅氧烷涂层的毛细管柱结合二阶程序升温分离检测[23-24]。升温程序：120℃维持10 min，然后以3.2℃/min升温至230℃，维持35 min。进样口温度：250℃。检测器温度：300℃。载气：氮气。柱前压：190 kPa。分流比：1∶50。氢气和空气流速分别为30 mL/min和400 mL/min。

取共轭亚油酸（CLA）标准溶液及测试液各2 μL进样，以色谱峰面积定量。

1.2.8 CLA含量计算

试样中CLA含量以质量分数Xi计，数值单位以mg/g表示，按下式计算：

式中：Ai为试液中第i种CLA峰面积；Ais为标准溶液中第i种CLA峰面积；Ci为标准溶液中第i种CLA浓度，μg/mL；m为试样质量，g；V为试样体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂对脂肪提取率的影响

索氏抽提是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，重复回流提取，增加了油脂与纯溶剂的接触机会，大大减少了油脂的提取时间[25]，不同溶剂对脂肪提取率的结果见表2。

表2 不同溶剂对脂肪提取率的影响Table 2 Effect of different solvents on the extraction rate of fat

不同溶剂对滩羊尾中脂肪的提取率存在显著性差异（p＜0.05），其中石油醚对脂肪的提取率效果最好，为91.66%，正己烷与异丙醇相差不大，无水乙醇提取率最低为59.15%，因此选用石油醚为提取脂肪的溶剂。

2.2 对比不同提取温度、时间和料液比对脂肪提取率的影响

以石油醚为提取溶剂，分别比较不同温度、不同提取时间、不同料液比对脂肪提取率的影响，结果如图1所示。

综上所述，我国的经济得到了飞快的发展，城市化建设进程不断加快，产生了大量的交通问题，如交通排放物对环境的污染、交通拥堵以及交通事故频繁发生等问题，使人们越来越追求交通的顺畅性和环保性。近年来，物联网技术的不断发展为解决交通问题带来了很多好的技术支持，给智慧交通的发展带来了很好的动力和新的发展方向，从而便于交通系统的智能化发展，为交通服务和决策提供数据方面的支持，这样不仅可以合理地使用交通设施，还能改善交通拥堵的情况，从而为人们的生活提供顺畅便利的交通环境。

脂肪提取率随着提取温度的升高和提取时间的延长，均呈现先升高后降低的趋势，并在60℃和8 h时提取率达到最高，而料液比对脂肪提取率的影响并不明显。

2.3 抽提参数的响应面优化

在单因素试验的基础上，对提取时间、温度、料液比进行响应面优化试验，研究采用Box-Benhnken中心组合设计，选取时间、温度、料液比为自变量，以脂肪提取率为响应值设计三因素三水平响应面试验，结果见表3。

图1 不同温度、时间和料液比对脂肪提取率的影响Fig.1 Effect of different temperature，time and material solvent ratio on fat extraction rate

表3 响应面设计方案及试验结果Table 3 Design proposal and experiment result of response surface

利用Design Expert 8.0.6软件对试验结果进行方差分析，将试验数据进行多元回归拟合，得到脂肪提取率（R）对时间（A）、温度（B）、料液比（C）的回归方程为：

R=89.62-0.19A+0.98B+0.15C-0.032AB-0.036AC-0.92BC-2.94A2-2.87B2-0.72C2

图2为时间、温度和料液比交互作用对脂肪提取率的响应曲面图。由图2可以看出，时间、温度、料液比这3个变量，在两两交互时，保持其中一个变量不变，随着另外两个变量的增加，脂肪提取率呈现上升的趋势，当达到一定值时又呈现出下降趋势，提取时间和提取温度对脂肪提取率影响较大。

图2 脂肪提取率响应面图Fig.2 Fat extraction rate response surface

应用响应面优化分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果见表4。

表4 响应面优化结果Table 4 Results of response surface optimization

为检验在响应面优化出的条件下所得结果的可靠性，按照提取温度62℃、提取时间8 h以及料液比为1∶30（g/mL）进行验证试验，得到的脂肪提取率为89.462%，响应面优化的预测值与试验值之间的拟合性良好，从而证实了模型的有效性。

2.4 短程分子蒸馏技术提取羊尾油脂中共轭亚油酸工艺

从上述过程中得到了精炼的羊尾油脂，进一步利用短程分子蒸馏技术研究了羊尾油脂中共轭亚油酸最佳的蒸馏温度，并建立羊尾油脂中提取共轭亚油酸的短程分子蒸馏技术工艺。在短程分子蒸馏过程中，蒸馏温度是最重要的参数之一[26]，本研究发现当蒸馏的温度小于250℃时，轻相分馏物所占百分比极少，说明羊尾脂肪里的成分未有效分离；从250℃开始，羊尾脂肪中较小的组分先被分离，但产率小，轻相分馏物产率只有8.75%，逐渐升温，当温度升高至290℃时，轻相分馏物产率显著上升。不同蒸馏条件所得到的轻相和重相分馏物如表5所示。

表5 不同蒸馏条件对分馏物的影响Table 5 Effect of different distillation conditions on fractions

2.5 分馏物中CLA含量的测定

分别配制CLA标准溶液至浓度为219.78、109.89、54.95、10.99、5.49 μg/mL。以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示。得到CLA线性回归方程 y=0.227 742 7x-0.349 376 1，R2=0.999 39。

不同蒸馏温度下CLA的含量见图4。

图3 浓度与峰面积的标准曲线Fig.3 Standard curve of concentration and peak area

图4 不同蒸馏温度下CLA的含量Fig.4 CLA content at different distillation temperatures

对羊尾脂肪及其在不同蒸馏温度下的分馏物进行共轭亚油酸含量的定量分析，发现羊尾脂肪中共轭亚油酸含量随蒸馏温度呈正相关关系，如图4所示，蒸馏温度由250℃至335℃变化的过程中，CLA含量从250℃的2.13 mg/g，提升到320℃的19.35 mg/g，这是由于共轭亚油酸是中长链脂肪酸，随着温度升高，首先蒸馏出短链脂肪酸，之后蒸馏出长链脂肪酸，在315℃时，十八碳脂肪酸开始分离出，导致在315℃时，CLA的含量大幅度上升，达到18.65 mg/g，继续升高温度，长链脂肪酸开始分离，对十八碳脂肪酸影响不大，故CLA在轻相中的相对含量开始下降。因此从羊尾油脂中分离CLA的最佳蒸馏温度是320℃，在此条件下，CLA的含量为19.35 mg/g。

3 结论

通过对比正己烷、石油醚、环己烷、异丙醇、无水乙醇对于油脂的提取效果，发现石油醚提取油脂效果要优于正己烷、环己烷和无水乙醇，通过响应面法确定了最佳油脂提取条件为提取温度62℃、提取时间8 h以及料液比为1∶30（g/mL），在该条件下，油脂提取率可达到89.46%。在上述研究基础上，根据不同脂肪酸的平均自由程不同，利用短程分子蒸馏技术对提取的油脂进行共轭亚油酸的蒸馏工艺研究，确定了当蒸馏温度为320℃，真空度为1 mbar时，可有效地从羊尾油脂中蒸馏出共轭亚油酸，此时蒸馏轻相中共轭亚油酸的含量为19.35 mg/g，比传统分馏方法产率高59.58%。研究和开发羊尾脂高值化利用技术，可显著提升其经济价值，减少环境污染，这对于增加牧民收入，发展绿色畜牧业，实现农业供给侧结构性改革和乡村振兴具有重要意义。