分光光度法检测特殊医学用途婴儿配方乳粉中左旋肉碱

张海红，田洪芸，王文特，任雪梅，王骏

(1.山东省食品药品检验研究院，济南 250101;2.山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，济南 250101)

0 引 言

左旋肉碱（L-carnitine）又称肉毒碱或维生素BT，是人类必须的一种营养物质，其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸氧化，为机体提供能量[1-2]。人体的左旋肉碱来源：一是通过肝脏和肾脏进行内源性合成，二是从膳食摄取（主要是动物性食品）[3]。人体左旋肉碱缺乏将影响脂肪酸的代谢，从而导致能量合成不足，出现易疲劳、肌肉无力、心慌等症状，严重者会出现代谢紊乱，昏迷甚至死亡。随着人们对左旋肉碱营养价值的关注及认可，它已经被越来越多地用于减肥食品、婴幼儿食品、饮料、营养补充剂、临床等方面[4]。婴幼儿机体尚未发育成熟，自身不能合成左旋肉碱或合成量不能满足机体需要，所以准确定量婴幼儿配方食品中的左旋肉碱含量，对保障婴幼儿营养摄入是至关重要的[5]。GB 10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》、GB 10767-2010《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》、GB 29922-2013《食品安全国家标准特殊医学用途配方食品通则》和GB 25596-2010《食品安全国家标准特殊医学用途婴儿配方食品通则》均将左旋肉碱列为可选择性添加的营养成分，并规定了最小添加量。

目前左旋肉碱的检测主要采用分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、化学法、毛细管电泳色谱法和免疫法等[6-11]。我国现行相关检测方法标准为GB 29989-2013《婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定》[12]，属于分光光度法，适用范围为婴幼儿食品和乳品。在日常检验工作中发现，对于氨基酸配方和蛋白质水解配方特殊医学用途婴儿配方食品，同时配料中添加了麦芽糊精和预糊化淀粉的产品，存在以下缺点：(1)高氯酸沉淀蛋白后样品溶液难以过滤，过滤时间比较长，影响了实验效率和批量化要求;(2)过滤下来的滤液不澄清，吸光度值通常大于1，不满足分光光度比色的溶液要求，严重影响紫外吸收的测定，数据离散性大，加标回收率不好。原因有：一是氨基酸和小分子量多肽是小分子，高氯酸沉淀剂不能将其沉淀下来，普通滤纸不能过滤掉，甚至会堵塞滤纸孔，导致过滤速度慢和滤液浑浊；二是样品配料添加的麦芽糊精和预糊化淀粉的冷水溶胀，黏度增大，也会使样品处理液难以过滤[1-14]。

本研究在GB 29989-2013标准的基础上，利用Taka淀粉酶来水解样品中麦芽糊精和预糊化淀粉，对前处理方法加以改进，克服以上缺点，建立了氨基酸配方和蛋白质水解配方特殊医学用途配方食品中左旋肉碱的检测方法，并对圣元优博、青岛瀚姆、贝因美、雅培、雀巢、纽迪希亚等6家以上企业的氨基酸配方和蛋白质水解配方特殊医学用途配方食品或试制品进行了测定，拟为这类特殊医学用途配方食品的质量安全监管和质量控制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外可见分光光度计Evolution 300，美国赛默飞世尔公司；恒温水浴锅DZKW-S-6，北京市永光明医疗仪器有限公司。

纯度≥98%左旋肉碱对照品，美国Sigma公司；分析纯高氯酸，天津市鑫源化工有限公司；分析纯氢氧化钠、氢氧化钾、乙二胺四乙酸二钠，国药集团化学试剂有限公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、乙酰肉碱转移酶(CAT)、TaKa淀粉酶，均为美国Sigma公司；乙酰辅酶A，罗氏公司。

婴儿配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和乳蛋白部分水解配方特殊医学用途配方食品均为日常工作中的检验样品，涉及6家以上国内外生产企业。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

左旋肉碱标准储备液（80μg/mL）：精确称取20 mg于102±2℃烘箱中烘2 h的左旋肉碱（纯度≥98%），用水定容至250 mL容量瓶中。此溶液可在4℃冰箱中保存1个月。

左旋肉碱标准工作液：分别吸取左旋肉碱标准储备液0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，该标准系列浓度分别为1.6、3.2、6.4、9.6、16μg/mL。现用现配。

高氯酸溶液（13%）：移取13 mL高氯酸用水稀释至100 mL。

氢氧化钠溶液（10 mol/L）：称取40 g氢氧化钠用水溶解，冷却后稀释至100 mL。

氢氧化钾溶液（4.0 mol/L）：称取22.4 g氢氧化钾用水溶解，冷却后稀释至100 mL。

显色储备液：分别称取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 g N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、0.185 g乙二胺四乙酸二钠溶于30 mL水中，用10 mol/L氢氧化钠溶液调p H至7.4～7.6，用水定容至50 mL。显色储备液可在4℃冰箱中保存3个月。

显色工作液：吸取5.00 mL显色储备液用水定容至25 mL。现用现配。

乙酰辅酶A（Acetyl CoA）溶液：称取20.0 mg乙酰辅酶A溶于2.0 mL水中。现用现配。

乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液：吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，加入2 mL水溶解。现用现配。

TaKa淀粉酶溶液：称取2.50 g TaKa淀粉酶溶于50 mL水中。现用现配。

1.2.2 样品前处理

（1）试样提取。称取试样5 g（精确至0.0001 g）于50 mL烧杯中，用30 mL 40℃温水溶解并转入100 mLl容量瓶中，准确加入TaKa淀粉酶溶液1 mL，混匀，于60℃水浴水解30 min，再加入10 mL 13%高氯酸溶液，混合均匀后静置20 min，用水定容至刻度，混匀，用定量快速滤纸过滤。

（2）测定液的制备。移取滤液20 mL，置于50 mL广口锥形瓶中，用4 mol/L氢氧化钾溶液调整滤液p H至12.5～13.0，置于40℃水浴60 min。取出冷却后用高氯酸溶液调整pH至7.0～7.5。将溶液转入50 mL容量瓶中，用水定容，混匀，于4℃冰箱中放置过夜。

将试样处理液从冰箱中取出，放置至室温，用一次性注射器吸取上清液，用0.45μm滤膜过滤于5 mL PE离心管中备用。

1.2.3 测定

分别吸取左旋肉碱标准工作液、滤膜过滤后的试样测定液2.0 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL显色工作液、100μL乙酰辅酶A溶液，盖上比色皿盖，混合均匀，放置5 min后立即放入已用水调零的紫外可见分光光度计中，在波长为412 nm下测定吸光值A1并迅速加入100μL乙酰肉碱转移酶溶液，迅速混合均匀，放置10 min立即后于紫外可见分光光度计中测定吸光值A2。以左旋肉碱标准工作液的浓度为横坐标，以标准工作液的吸光值A2与吸光值A1之差为纵坐标，制作标准曲线。用试样测定液的吸光值A2与吸光值A1之差在标准曲线上查得试样测定液中左旋肉碱的浓度，进而计算样品中左旋肉碱含量。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

选取一种氨基酸特殊医学用途配方乳粉A，该样品配料中添加了麦芽糊精(在配料表中第一位)和预糊化淀粉，按照国标方法，样品处理液难以过滤，滤液不澄清。

2.1.1 加酶量

称样5.0 g，加一定量的酶(如1%，就是5 g样品，加0.05 g酶)，水浴温度60℃，水浴时间30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，静置20 min，定容，摇匀，过滤，考察加酶量为0%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%时样品过滤液的透光率。具体数据见图1所示。

图1 样品溶液的透光率随加酶量的变化

由图1可以看出，随加酶量的增加，样品溶液的透光率显著增大，并于加酶量0.5%之后趋于稳定并稍有下降，因此确定1%为最佳加酶量。

2.1.2 水解时间

称样5.0 g，加酶量1%，水浴温度60℃，水解一定时间。水解后，加10 mL 13%高氯酸，静置20 min，定容，摇匀，过滤，考察水解时间为5、10、20、30、40、50、60 min时样品过滤液的透光率。具体数据见图2所示。

图2 样品溶液的透光率随水解时间的变化

由图2可以看出，随水解时间的延长，样品溶液的透光率逐渐增大，并于10 min之后趋于稳定。鉴于特殊医学用途配方乳粉基质复杂，适当延长样品的水解时间，确定最佳水解时间为30 min。

2.1.3 水解温度

称样5.0 g，加酶量1%，一定温度下水解30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，静置20 min，定容，摇匀，过滤，测定样品过滤液透光率。通常淀粉酶的使用温度为45～70℃[15]，考察了水浴温度40、50、60、70℃时样品过滤液的透光率。具体数据见图3所示。

由图3可以看出，样品溶液的透光率先逐渐增大，后稍有下降，并且50℃以上时，样品溶液的透光率都大于90%，因此确定最佳水解温度为60℃。

2.1.4 沉淀剂用量

图3 样品溶液的透光率随水浴温度的变化

Taka淀粉酶水解了麦芽糊精等淀粉类物质，同时为了避免Taka淀粉酶对后面的左旋肉碱酶反应有影响和消除蛋白质及其多肽链影响[16]，需要进一步把样品溶液中的Taka淀粉酶和样品蛋白质沉淀下来。称样5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加一定体积的13%高氯酸溶液，静置20 min，定容至100 mL，摇匀，过滤，考察了0、2.5、5.0、7.5、10.0mL高氯酸溶液加入量的对样品过滤溶液透光率的影响。具体数据见图4所示。

图4 样品溶液的透光率随高氯酸溶液加入量的变化

由图4可以看出，随着高氯酸溶液加入量的增大，样品过滤液的透光率逐渐增大并在5 mL之后趋于稳定。因此10 mL 13%高氯酸溶液加入量是足够的，与国标方法一致。

因此，确定了最佳前处理条件，称样5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加10 mL 13%高氯酸溶液，混匀，静置20 min，定容至100 mL，混匀，过滤。

2.2 线性曲线及检出限

在波长412 nm处样品测定液反应前后吸光度值，并绘制标准曲线(见图5)，2 mL测定液中左旋肉碱浓度在0～16μg/mL范围内(相当于5 g样品中左旋肉碱含量0～80 mg/100g)呈良好的一次线性关系，相关系数r2为0.9998，样品检测限(LOD)为2mg/100g，与国标方法一致。

2.3 精密度实验

选取婴儿配方乳粉R和氨基酸特殊医学用途配方乳粉A，进行精密度实验，并与国标方法对比。具体数据见表1。

可见，对于婴幼儿配方乳粉R，未酶解样品的左旋肉碱平均值为19.0 mg/100g，相对标准偏差RSD为2.78%；酶解样品的左旋肉碱平均值为18.9 mg/100g，相对标准偏差RSD为1.69%。两种前处理结果一致，数据分布集中，精密度好，相对标准偏差都符合实验质量控制要求[17]。

图5 左旋肉碱标准曲线

对于氨基酸配方特殊医学用途配方乳粉A，未酶解样品的左旋肉碱平均值为53.1 mg/100g，相对标准偏差RSD为9.56%，数据离散程度大；酶解样品的左旋肉碱平均值为60.5 mg/100g，相对标准偏差RSD为2.40%。说明，对于氨基酸配方特殊医学用途配方食品A，只有酶水解样品精密度好，符合实验质量控制要求。

2.4 加标回收率实验

选取氨基酸特殊医学用途配方乳粉A，在5 mg/100g、15 mg/100g和50 mg/100g 3个添加水平下进行加标回收实验，并与国标方法进行对比。具体数据见表2。

对于婴幼儿配方乳粉R，在3个添加水平下，未酶解样品的加标回收率为98.0%～103.0%，相对标准偏差RSD为0.89%～3.30%;酶解样品的加标回收率为100.3%～104.5%，相对标准偏差RSD为0.82%～2.48%。说明，对于婴幼儿配方乳粉，未酶解和酶水解样品的加标回收率和相对标准偏差都符合实验质量控制要求。

对于氨基酸配方特殊医学用途配方乳粉A，在3个添加水平下，未酶解样品的加标回收率为81.7%～109.6%，相对标准偏差RSD为10.3%～12.7%，在5 mg/100g低加标水平下，加标回收率偏低，同时3个水平的数据相对标准偏差均大于4，数据离散程度大，不符合实验质量控制要求;酶解样品的加标回收率为96.1%～108.5%，相对标准偏差RSD为3.18%～3.85%，加标回收率比较好，实验数据精密度高。说明，对于氨基酸配方特殊医学用途配方乳粉A，只有酶水解样品的加标回收率和相对标准偏差符合实验质量控制要求。

2.5 实际样品测定

目前市场上氨基酸及蛋白质水解配方特殊医学用途配方乳粉配料表中碳水化合物来源主要是以下几种：麦芽糊精、预糊化淀粉、玉米糖浆、葡萄糖浆、白砂糖、乳糖和淀粉糖，其中添加最多的是麦芽糊精和葡萄糖浆。采用酶水解前处理方法，考察了多种品牌的氨基酸及蛋白质水解配方特殊医学配方乳粉或试制品左旋肉碱的检测情况。

2.5.1 不同基质样品的精密度实验

考察了8种特殊医学用途婴儿配方乳粉，其中YA和YP样品添加了乳糖、麦芽糊精和白砂糖，YPYB样品添加了乳糖、固体玉米糖浆和麦芽糊精，YPYM样品添加了固体玉米糖浆、预糊化淀粉和麦芽糊精，TT样品只添加了葡萄糖浆，SMY和SLL添加了麦芽糊精和葡萄糖浆，AA样品添加了麦芽糊精和预糊化淀粉，检测结果见表3。

未酶解样品，除了TT样品，其他样品过滤速度较慢，检测结果相对标准偏差RSD为3.04%～12.6%，数据离散程度大，精密度不好。对于酶解样品，酶水解和沉淀蛋白后，均易于过滤，滤液澄清，检测结果相对标准偏差RSD为2.62%～3.75%，精密度比较好。

表1 2种前处理方法的左旋肉碱检测结果

表2 加标回收率和相对标准偏差（n=6）

表3 2种前处理方法的左旋肉碱检测结果

表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6） %

2.5.2 不同基质样品的加标回收率实验

选取3种样品，进行酶水解前处理，在15 mg/100g添加水平进行加标回收实验，样品加标回收率结果见表4。

3种酶解样品的加标回收率为102.7%～108.8%，相对标准偏差RSD为1.76%～3.85%，加标回收率比较好，实验数据精密度高。说明对于不同基质的氨基酸和蛋白质水解配方特殊医学配方乳粉中左旋肉碱的检测，本方法具有比较好的准确性和精密度。

3 结 论

采用Taka淀粉酶水解样品的前处理方法简单、易于操作、干扰因素少。对于氨基酸及蛋白质水解配方特殊医学用途配方乳粉，该方法的精密度高，加标回收率好。同时解决了氨基酸及蛋白质水解配方特殊医学用途配方乳粉过滤难和滤液不澄清的问题，缩短了前处理时间，提高了检测效率，灵敏度高，重复性好，满足了氨基酸配方和蛋白质水解配方特殊医学配方乳粉中左旋肉碱批量化检测需求[18-19]。