中国常见水稻病毒病鉴定方法研究进展

庄新建，徐红梅，甘海峰，贺振，刘芳，张坤

(扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州 225000)

我国是世界上种植水稻历史最悠久的国家，在我国粮食生产中，水稻播种面积占整个粮食作物播种面积的25%～30%，总产量则占全国粮食总产量的40%～45%，不论是单产还是总产都占粮食生产的第一位[1]；同时，我国有三分之二的人口以稻米为主食，因此，水稻生产在我国国民经济中占有重要地位[1]。但水稻的生长发育经常受到各种生物与非生物因素的胁迫，其中包括病毒危害[2]。水稻病毒病被称为“水稻癌症”，是当今国内外难以攻克的“绝症”，是水稻的重要病害，严重影响水稻生产[3]。例如，1992年3种水稻病毒病对世界水稻危害所造成的经济损失就达16.49亿美元[4]。

目前，我国已发现10多种水稻病毒病，主要包括水稻矮缩病毒、水稻瘤矮病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹叶枯病毒、水稻白叶病毒、水稻草状矮化病毒、水稻黄矮病毒、水稻东格鲁杆状病毒、水稻东格鲁球状病毒、水稻黄斑驳病毒、水稻坏死花叶病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻病毒A、水稻齿叶病毒。我国水稻病毒病种类很多，且发生时段和地域有重叠，给水稻病毒病的检测与防治带来了困难。现有的水稻病毒检测方法虽然有很多，但是能快速而准确地于田间根据症状判断病原与检测的方法却十分混乱，本文旨在给水稻病害的检测方法提供更多选择，从而便于田间工作者快速准确地检测出水稻病毒的类别，给水稻病毒病害的预测和防治奠定良好的基础。

1 水稻病毒的分类

1.1 水稻矮缩病毒

水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus, RDV)是呼肠孤病毒科(Reovirudae)呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的成员。在自然条件下，RDV可以通过黑尾叶蝉(Nephotettixcincticeps)或电光叶蝉(Reciliadorsalis)进行传播，并可通过虫卵传给下一代[5]。该病毒广泛分布于中国福建、云南的水稻种植区，造成水稻的严重减产[6]。水稻在苗期至分蘖期感染RDV后，病株出现矮缩、分蘖增多、叶片浓绿、僵直的症状(图1中A)，生长后期病株不能抽穗结实[7]。RDV是一种直径约70 nm的二十面体双壳粒子(图2中A)，其基因组由12个双链RNA片段组成(S1～S12)。RDV基因组编码7个结构蛋白(P1、P2、P3、P5、P7、P8和P9)和5个非结构蛋白(Pns4、Pns6、Pns10、Pns11和Pns12)。RDV衣壳的外壳由2种蛋白(P2和P8) 组成，内芯由另外5种结构蛋白(P1、P3、P5、P7和P9)组成[8]。

1.2 水稻瘤矮病毒

水稻瘤矮病毒(Ricegalldwarfvirus, RGDV)于1980年首次在泰国中部发现，随后在中国的广东、广西、福建也有发现[9]。RGDV主要由电光叶蝉 (Reciladorsalis)和黑尾叶蝉(Nephotettixcincticeps)以持久性方式传播，仅感染禾本科植物，病株严重矮缩(图1中B①)，在叶背和叶鞘上长出淡黄绿色近圆形小瘤(图1中B②)，可引起水稻严重减产[10]。RGDV属于呼肠孤病毒科 (Reoviridae)呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)。病毒粒体为球形二十面体，有双层衣壳，直径约为65～70 nm(图2中B)。其基因组包含12条双链RNA片段，按照在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率从小到大的顺序，分别命名为S1～S12[11]。

1.3 南方水稻黑条矮缩病毒

南方水稻黑条矮缩病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus, SRBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae) 斐济病毒属 (Fijivirus)，SRBSDV病毒粒体呈球状(图2中C)，具有双层外壳，直径约为70～75 nm[12]。近年来我国江西、湖南、广东、海南等省水稻矮缩病发生严重，据不完全统计，受害面积超过3×105hm2，约6 500 hm2水稻失收[13]。白背飞虱以持久性方式传播SRBSDV，病毒可在虫体内复制增殖，虫体一旦获毒，即终生带毒[14]。发病水稻出现叶色浓绿(图1中C①)、明显矮缩(图1中C②)、分蘖增多(图1中C③)的症状；病株茎秆上有乳白色或黑褐色瘤状突起(图1中C④)，高位分枝并在节间产生倒生须根；病株根系不发达，须根少而短[15]。SRBSDV的基因组由10条线性双链RNA组成，总长度为29 121 bp，根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率由慢到快依次命名为S1到S10[16]。

1.4 水稻黑条矮缩病毒

水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus, RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)，主要经灰飞虱(LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式传播[17]。完整的RBSDV病毒粒子为二十面体结构，外观呈球形(图2中D)，直径约75 nm，由双层衣壳组成，内外层衣壳上各存在12个突起，衣壳内部含有10条双链RNA基因组片段，按其在凝胶上的电泳迁移率由慢至快依次称为S1～S10[18]。感染RBSDV的水稻植株为浓绿矮缩，叶片僵直，不抽穗或穗小，叶背的叶脉和茎秆上有短条瘤状突起(图1中D)，该突起在发病初期呈蜡白色，后变为黑褐色，发病重的田块甚至会绝产绝收[19]。近年来，RBSDV在江苏、浙江、山东等地都有发生，且呈明显的上升趋势。RBSDV还可引起玉米粗缩病、小麦绿矮病，也能侵染多种禾本科杂草[20]。

1.5 水稻条纹叶枯病毒

水稻条纹叶枯病毒(Ricestipevirus, RSV)是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员，通过灰飞虱(Laodelphaxstriatellus)以持久循回增殖的方式传播，且RSV可以通过昆虫经卵传递给下一代[21]。感染RSV的水稻病株经常出现褪绿的条纹斑点或斑块(图1中E)，一般最早出现在嫩叶，根据病株表现症状可以分为卷叶型和展叶型2类[22]。水稻条纹叶枯病主要分布于中国16个省市，给中国水稻生产造成严重损失[23]。RSV是单链RNA病毒，其基因组含有4条RNA链，分别为RNA1、RNA2、RNA3和RNA4，其病毒基因组链(vRNA) 和vcRNA各编码1个蛋白，分别称之为NS2 (p2)、NSvc2 (糖蛋白)、NS3 (p3)、NSvc3 (核衣壳蛋白)、NS4 (病害特异性蛋白)和NSvc4 (运动蛋白)[24]。RSV在形态上呈现出多型性，主要是表现为宽8～10 nm、长80～250 nm的分枝丝状体(图2中E)，有些表现为直径3～8 nm的开环环状体，但其中8 nm宽的粒子一般认为是由直径3 nm长度不等的丝状体缠绕而成[25]。

1.6 水稻白叶病毒

水稻白叶病毒(Ricehojablancavirus, RHBV)是纤细病毒属(Tenuivirus)的成员，RHBV基因组包含4条单链RNA和3条双链RNA，RHBV的RNA介导2种主要蛋白的合成，RNA3介导23 ku的NS3蛋白合成，RNA4介导21 ku NS4蛋白合成。RHBV的病毒粒子呈细丝状，3～8 nm宽(图2中F)，并且长度是可变的[26]。RHBV由稻飞虱(Tagosodesorizicolus)传播，在水稻中引起白叶病，给热带和亚热带美洲主要水稻生产国造成了严重的损失[27]。感染RHBV的病株症状通常包括叶片上的绿化条纹(图1中F)、植株矮化和穗部不育，造成水稻产量大幅下降。

1.7 水稻草状矮化病毒

水稻草状矮化病毒(Ricegrassystuntvirus, RGSV)于1963年在菲律宾首次被发现，经褐飞虱(Nilaparvatalugens)以持久性方式传播。RGSV也是纤细病毒属(Tenuivims)的成员，病毒粒体由核衣壳蛋白和基因组RNA组成。病毒粒子为直径4～8 nm的线状或长分枝形丝状粒体(大部分长950～1 350 nm) (图2中G)，并能形成环状结构[28]。RGSV于20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积发生，之后在我国的福建、台湾、广东、广西和海南等地也有发生[29]。RGSV基因组由6条单链RNA组成，其6个片段均釆用双义编码策略[30]。植株感染后，一般呈现明显矮化、分蘖增多、叶片褪绿条纹明显，叶片细小、叶窄而刚、淡绿到淡黄或橙黄色，有时在叶片上会形成大量形状不规则的暗褐色或锈色小斑(图1中G)，感病植株基本不抽穗[28]。

A—水稻矮缩病毒侵染水稻出现矮缩、分蘖增多症状；B—水稻瘤矮病毒侵染水稻出现严重矮缩①、叶背上圆形或近圆形瘤状突起的症状②；C—南方水稻黑条矮缩病毒侵染水稻出现叶色深绿①、矮缩丛生②、高位分蘖③、倒生须根、抽穗困难、旗叶宽短和叶面凹凸④等症状；D—水稻黑条矮缩病毒侵染水稻出现明显矮缩、叶片僵直等症状；E—水稻条纹叶枯病毒侵染水稻出现明显褪绿的条纹斑点或斑块的症状；F—水稻白叶病毒侵染水稻出现绿化条纹的症状；G—水稻草状矮化病毒侵染水稻出现明显矮化、分蘖增多、叶片褪绿条纹明显，叶片细小、叶窄而刚症状；H—水稻黄矮病毒侵染水稻出现黄化、分蘖减少，植株矮化，株形松散等症状；I—水稻东格鲁球状病毒侵染水稻出现叶片颜色为橙色至黄色等症状；J—水稻黄斑驳病毒侵染水稻出现黄斑、分蘖减少症状；K—水稻坏死花叶病毒侵染水稻出现矮化，分蘖增生，新叶皱缩、扭曲症状；L—水稻东格鲁杆状病毒侵染水稻出现黄叶、斑驳等症状；M—水稻条纹花叶病毒侵染水稻出现黄色条纹①、扭转畸形②等症状；N—水稻齿叶病毒侵染水稻出现卷叶①、叶片深绿②、明脉肿③等症状。图1 水稻病毒病的症状资料来源:文献[12, 41-52]。

A—水稻矮缩病毒粒子直径约70 nm的二十面体双壳粒子；B—水稻瘤矮病毒粒子为球状二十面体；C—南方水稻黑条矮缩病毒粒子呈球状(CW为细胞壁)；D—水稻黑条矮缩病毒粒子为二十面体结构，外观呈球形；E—水稻条纹叶枯病毒粒子为分枝丝状体；F—水稻白叶病毒粒子呈细丝状；G—水稻草状矮化病毒粒子为线状或长分枝丝状粒体；H—水稻黄矮病毒粒子为弹状；I—水稻东格鲁球状病毒粒子具有直径30 nm的等径球体；J—水稻黄斑驳病毒粒子是等距的、直径约26 nm；K—水稻坏死花叶病毒粒子为丝状；L—水稻东格鲁杆状病毒粒子为杆状；M—水稻条纹花叶病毒粒子为杆状体(箭头表示囊泡结构中聚集了病毒粒子，字母M为线粒体)；N—水稻齿叶病毒粒子呈二十面体结构。图2 水稻病毒粒子的透射电镜资料来源:文献[7, 41, 51, 60-69]。

1.8 水稻黄矮病毒

水稻黄矮病毒(Riceyellowshuntvirus, RYSV)是弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞核弹状病毒属 (Nudeorhabdovirus)的成员，其基因组由1条长负义单链RNA组成[31]，RNA的长度约为12 kb[32]。病毒弹状粒子长度为120～136 nm、宽度为88～100 nm (图2中H)，具有(83～100) nm×(40～50) nm大小的核心，外壁厚度约25 nm[33]。目前发现，该病毒的寄主是水稻，RYSV主要由黑尾叶蝉 (Nephotettixcincticeps)以持久性方式传播，病稻汁液和种子不能传播病毒[32]。RYSV于1964年最早在中国广东发现，之后在中国南方各个省份广泛流行[32]。水稻黄矮病主要特征是矮化、花叶、黄枯，在水稻分蘖期发生。病株少分蘖、矮化，株形松散(图1中H)，根系短小衰朽，轻病株抽穗推迟，谷穗短小。谷穗不能抽出或抽出半包穗，谷粒发育不良，秕谷多，若防治不及时，一般会使水稻减产20%～80%[33]。

1.9 水稻东格鲁球状病毒

水稻东格鲁球型病毒(Ricetungrosphericalvirus，RTSV)属于伴生病毒科(Sequiviridae)矮化病毒属(Waikavirus)[34]。RTSV病毒粒子具有直径30 nm的等径球体(图2中I)[35]，内部包含多聚腺苷酸单链RNA，其基因组由大约12 kb的单链RNA组成，它编码一个393 ku的大型多聚蛋白和3′端2个开放阅读框。只感染RTSV症状较轻，如轻度发育迟缓(图1中I)，但是同时感染RTBV和RTSV的植物病状会加重[36]。RTSV主要由二点黑尾叶蝉 (Nephotettixvirescens)、黑尾叶蝉(N.cincticeps)、二条黑尾叶蝉 (N.nigropictus)等以半持久性方式传播的[35]。

1.10 水稻黄斑驳病毒

水稻黄斑驳病毒(Riceyellowmottlevirus，RYMV)是南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)的成员[37]。这种病毒能通过机械和蛹虫传播，在非洲引起严重疾病。病毒感染时，最幼嫰叶片底部出现黄色或变色的点，这些点以平行于叶脉的方式扩张；受感染的叶片会变成黄色或橙色，导致分蘖减少，植株发育不良[38](图1中J)。RYMV病毒粒子是等距的、直径约26 nm的球形结构(图2中J)。RYMV基因组由4 450 nt长的单链RNA组成，包含4个开放阅读框(ORFs)。ORF1编码未知功能蛋白P1 (17.8 ku)。ORF2编码110 ku的多聚蛋白。ORF3嵌套在ORF2不同的阅读框中，编码功能未知的蛋白p3 (13.7 ku)。ORF4编码26 ku的外壳蛋白(CP)[39]。

1.11 水稻坏死花叶病毒

水稻条纹坏死病毒(Ricenecrosismosaicvirus, RNMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae) 大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的成员。RNMV首先在日本被发现，随后在印度的水稻种植区中也发现此病毒。该病毒侵染能引起水稻植株花叶症状，表现为下叶上的黄色斑点和条纹症状(图1中K)[40]。马铃薯Y病毒科中大麦黄花叶病毒属由2条正义单链RNA基因组组成，包括7.3～7.6 kb RNA1和3.5～3.7 kb RNA2。RNMV病毒粒子呈弯曲的杆状结构(图2中K)，其RNA被外壳蛋白(CP)包裹，形成直径13 mm、长度分别为550 nm和275 nm的丝状病毒粒子。感染RNMV的水稻病株矮化，分蘖增生，新叶皱缩、扭曲，叶片上有黄色条纹，后期沿叶缘出现条纹坏死。RNMV传播介体为多粘霉菌(Polymvxagraminis)，自然寄主仅限于水稻[40-52]。

1.12 水稻东格鲁杆状病毒

东格鲁病由2种形态和基因组不同的病毒引起，水稻东格鲁杆状病毒(Ricetungrobacilliformvirus, RTBV)是花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)[34]的成员。病毒粒子为杆状(图2中L)，粒子长度150～350 nm，由环状双链DNA和单一蛋白组成，RTBV是双链DNA病毒，通过RNA进行复制，其基因组包含3个双链DNA，其中2个为8 002 bp,一个为8 000 bp[33]。RTBV的DNA双链上各有1个不连续区域[53]。感染RTBV后的水稻植株会出现黄橙色的叶状变色和发育不良(图1中L)的症状[34]。RTBV主要由二点黑尾叶蝉(Nephotettixvirescens)、黑尾叶蝉(N.cincticeps)、二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)、马来亚黑尾叶蝉(N.malayanus)、细小黑尾叶蝉(N.parvus)和电光叶蝉(Reciliadorsalis)以半持久性方式传播[35]。

1.13 水稻条纹花叶病毒

水稻条纹花叶病毒(Ricestripemosaicvirus, RSMV)于2015年首次在中国广东省的稻田中被发现，RSMV是弹状病毒科(Rhabdoviridea)细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)的新成员[54]。RSMV由电光叶蝉(Reciliadorsalis)以持久增殖型方式传播。由RSMV引起的稻条纹花叶病常表现为植株轻度矮化，叶片呈黄色条带或镶嵌(图1中M①)，叶尖扭曲，重病株叶片基部扭转畸形(图1中M②)，抽穗不完全，籽粒不饱满[54]。RSMV病毒粒子为杆状，长度为300～375 nm，宽度为45～55 nm (图2中M)。其基因组为负义单链RNA，能编码2个非结构蛋白和5个结构蛋白[55]。

1.14 水稻病毒A

水稻病毒A (RicevirusA, RVA)首先在韩国被发现和报道，是番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)的成员，RVA基因组为4 832 nt[56]。RVA基因组存在5个开放阅读框(ORFs)，ORF1编码32 ku的蛋白(p32)，ORF2编码90 ku的蛋白，ORF3编码49 ku的外壳蛋白(CP)，ORF4编码1个24 ku的运动蛋白(MP)，ORF5编码19 ku的蛋白，很可能是一个沉默抑制子[56]。

1.15 水稻齿叶病毒

水稻齿叶病毒(Riceraggedstuntvirus, RRSV)于1976年首先在印度尼西亚和菲律宾发现，1978年以来先后在我国的福建、广东、台湾、江西、湖南和浙江等省发现[57]。RRSV经褐飞虱(Nilaparvatalugens)持久性传播，病株表现叶片扭曲、呈锯齿状缺刻(图1中N①)，浓绿矮缩(图1中N②)，在叶背和叶鞘生有细长脉肿(图1中N③)，分蘖期前发病能抽穗；后期发病则抽穗不完全、谷粒不充实等症状[58]。RRSV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)稻病毒属(Oryzavirus)的成员。RRSV的病毒颗粒具有双层外壳，呈二十面体结构，带有约宽20 nm、高10 nm的扁平突起，整病毒粒体直径约为70 nm (图2中N①)，核心颗粒直径约50 nm (图2中N②)。RRSV基因组包含10条双链RNA[59]。

2 水稻病毒的检测

目前，检测水稻病毒的方法有很多种，病毒的检测方法正朝着快速、灵敏、简便、准确的方向不断发展和改进。常用的植物病毒检测方法有生物学方法、免疫学方法、电子显微镜检测方法和分子生物学方法等[15]。本文主要对水稻病毒的分子检测方法和免疫学检测方法进行综述。

2.1 分子检测方法

水稻病毒的遗传物质通常是DNA或RNA，因此，可以从分子水平上去检测病毒是否存在，只要能检测到病毒核酸的存在，就证明了分子检测的有效性。随着分子生物学技术的发展，分子生物学方法已经成为水稻病毒检测的重要方法，主要包括核酸杂交技术(Technique of nucleic acid hybridization)、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)等。分子检测用到的主要引物见表1。

表1 水稻病毒分子检测使用的引物

表1(续)

表1(续)

2.2 免疫学检测方法

免疫学方法在水稻病毒检测中是一种常用、有效的方法。水稻病毒的主要成分是蛋白质和核酸结合而成的核蛋白，核蛋白是很好的抗原，特异性的抗体与相应的抗原结合会使抗原失去活力，这种过程称为免疫反应。目前水稻病毒检测中应用较为广泛的免疫学检测方法主要包括酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、斑点杂交印迹(dot-blot immunoassay, DIBA)、蛋白质印迹法(Western blot)等(表2)。

表2 免疫学方法检测的水稻病毒

表2(续)

3 小结

随着分子生物学的逐渐进步，分子检测技术广泛应用于水稻病毒的检测，该技术可有效检测昆虫介体和水稻的病毒。与免疫法相比，分子检测技术具有快速、灵敏和特异性强的优点，且不需要制备抗血清。但是在实用性和使用成本方面，RT-PCR方法所使用的仪器和试剂成本比较高，需要专业人员进行实验操作，并且不适于大量的样品检测。所以很难在基层植保工作中得以推广，目前只适合在实验室中对水稻病毒鉴定的结果进行必要的验证和补充。在免疫检测技术方面，目前应用较广泛的是利用间接ELISA法和DIBA法来检测介体昆虫带毒状况和田间水稻状况，进而对水稻病毒病害发生情况进行预测预报。这2种方法不仅拥有较高的准确性，还简化了操作程序，检测结果易于观察，使检测更加快速简便，同时适合大量样品检测。所以间接ELISA法和DIBA法检测水稻病毒病害适合在基层植保工作中普及。