浙贝母中贝母素甲和贝母素乙含量的调研

刘玉红，孙彩霞*，宗侃侃，赵学平，张岑容

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 2.磐安县中药材研究所，浙江 磐安 322300)

浙贝母(Fritillariathunbergii)是百合科贝母属多年生草本植物，其成熟期干燥鳞茎供入药所用，具有清热化痰、散结消痈的效用，历版《中国药典》均有收载[1-3]。浙江省是我国浙贝母主要种植区，种植面积和产量占全国90%左右，种植面积约0.333万hm2，是当地农户致富的主导产业[4]。磐安县作为浙江省浙贝母的主产区，其浙贝母产量占全国的60%以上。近年由于浙贝母无性繁殖、连作障碍和土壤微肥力难以把控等问题，导致其产量下降、品质参差不齐，尤其是老产区品质退化现象更为突出，严重影响了外界对于浙贝母疗效的评价[5-6]。传统的浙贝母成品质量评价主要以外观为依据，以鳞叶肥厚、质硬而脆、富粉性、断面色白者为佳，近年则多以浙贝母有效成分含量高低作为品质评价的内在指标[7]。浙贝母的药用有效成分是生物碱，其中贝母素甲和贝母素乙含量较高，且具有止咳平喘、镇痛抗炎和清热润肺等多种药理作用，成为评价其有效成分的主要指标[8-10]。《中国药典》评价浙贝母质量主要是通过测定贝母素甲和贝母素乙的总含量。HPLC-ELSD(蒸发光散射检测器)分析是检测贝母有效成分的一种有效方法，已用于多种贝母属植物的检测[11-13]，但鲜见在浙贝母上的报道。通过运用此法对磐安县抽检的浙贝母的干样和鲜样的贝母素甲和贝母素乙含量进行检测，以期引起相关部门对浙贝母品质把控的重视。

1 材料与方法

1.1 供试材料

浙贝母药材购自浙江磐安种植户，经浙江省中药研究所鉴定为浙贝母的鳞茎。贝母素甲和贝母素乙对照品购自中国药品生物制品检定所(批号分别为110750～201612、110751～201110)。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1100系列高效液相色谱仪及Agilent化学工作站(美国Agilent公司)；Alltech 3300蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)。

乙腈(色谱纯，韩国Honeywell公司)；二乙胺(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；甲醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；三氯甲烷(分析纯，杭州高晶精细化工有限公司)；水为超纯水，经杭州永洁达净化科技有限公司UPWS-Ⅰ-10(二级)超纯水器过滤。

1.3 前处理方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为美国ES CaprisilC18-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%二乙胺溶液(65∶35)，流速为1 mL·min-1，柱温为30 ℃；ELSD参数为漂移管温度90 ℃，氮气流速为1.5 mL·min-1，进样量20 μL。理论板数按贝母素甲峰计算应不低于2 000。

1.3.2 对照品溶液制备

精密称取干燥至恒重的贝母素甲和贝母素乙对照品适量，置容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至适当浓度，摇匀，制成每1 mL含0.240 mg贝母素甲和0.186 mg贝母素乙的溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.3.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约2 g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4 mL浸润1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)的混合液40 mL，称定重量，混匀，置80 ℃水浴中加热回流2 h，放冷，再称定重量，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合液补足减失的重量，滤过。精密量取续滤液10 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶液溶解并转移至2 mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，即得。

1.4 测定方法

分别精密吸取对照品溶液5、10、15 μL，供试品溶液5～15 μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量，即得。

1.5 方法学考察

1.5.1 线性关系

精密吸取对照品溶液3、6、9、12、15 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以对照品进样量(μg)为横坐标，分别绘制标准曲线，并计算回归方程，贝母素甲回归方程为Y=2 313.083X-1 211.220，r=0.994 7；贝母素乙回归方程为Y=2 001.971X-842.860，r=0.995 2。结果表明，贝母素甲在0.720～3.600 μg呈良好的线性关系，贝母素乙在0.558～2.790 μg呈良好的线性关系。

1.5.2 精密度试验

精密吸取贝母素甲和贝母素乙对照品溶液，重复进样6次，每次5 μL。结果显示，贝母素甲平均峰面积为2 322.8，相对标准偏差(RSD)为2.78%(n=6)；贝母素乙平均峰面积为1 499.4，RSD为2.93%(n=6)。

1.5.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，依上述色谱条件，分别在0、4、6、8 h进样5 μL测定。结果显示，贝母素甲平均峰面积为2 243.2，RSD为4.29%(n=4)；贝母素乙平均峰面积为1 492.7，RSD为4.38%(n=4)。表明供试品溶液在8 h内稳定。

1.5.4 重复性试验

分别取同一批号的浙贝母粉末样品7份，按供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件各进样5 μL测定，依上述条件测定贝母素甲和贝母素乙含量，结果浙贝母药材中，贝母素甲平均含量为0.111 4%，RSD为1.79%(n=7)；贝母素乙平均含量为0.072 3%，RSD为2.58%(n=7)。

1.5.5 加样回收率试验

取6份已知含量的供试品约1 g，精密称定，分别添加贝母素甲对照品溶液(0.412 mg·mL-1)和贝母素乙对照品溶液(浓度为0.372 mg·mL-1)各2 mL，按拟定的方法制成供试品溶液，依供试品测定方法进行测定。

1.5.6 水分检测

依据《中国药典》2015年版四部通则0832第二法烘干法。取浙贝母药材约2 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，打开瓶盖在105 ℃烘5 h，根据减失的重量，计算浙贝母药材中含水量。按上述条件测定浙贝母干样和鲜样中贝母素甲和贝母素乙的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱分析

由图1可知，在此色谱条件下，贝母素甲和贝母素乙与其他成分能较好地分离。

图1 对照品和样品溶液的HPLC谱图

2.2 加样回收率试验

表1表明，贝母素甲平均回收率为99.03%，RSD为2.96%(n=6)；贝母素乙平均回收率为95.47%，RSD为2.43%(n=6)。

表1 浙贝母中贝母素甲和贝母素乙的回收率

2.3 贝母素甲和贝母素乙含量

根据《中国药典》标准，贝母素甲和贝母素乙总量不得少于0.080%，水分不得超过18%。在磐安县调研的10个鲜样和10个干样测定结果(表2)表明，鲜样的贝母素甲和贝母素乙的总含量均超过0.080%，达到《中国药典》要求。但抽检的农户自行干燥的10个浙贝母干样里，有5个样品的贝母素甲和贝母素乙的总含量未达标，有些甚至只有《中国药典》所要求的一半。

表2 浙贝母干样和鲜样中贝母素甲和贝母素乙的含量

3 讨论与小结

研究表明，有效成分已成为道地药材品质评价的重要指标[14]。中药材的加工干燥是其药性形成的关键环节[15-18]，因此，加工方式对浙贝母的有效成分有直接影响。据文献记载[19]，浙贝母生品的加工主要有5种:贝壳粉吸法、生切脱水法、冷冻干燥法、微波干燥法和硫黄熏蒸法。其中，贝壳粉吸法需擦去表皮，会损失较多的表皮生物碱，且此法需要摊晒多日，易受气候因素的制约，产能效率低，已不再适用；生切片法不会造成表皮生物碱损失，但切片较薄，质地较脆，不利于运输，且加工能耗大。近年来冷冻和微波加工技术兴起，逐渐引起人们的关注[20]。虽然干燥样品的品质与形态俱佳，但设备昂贵，不适用于大批量浙贝母起土时加工。刘青梅等[21]利用热风-微波联合干燥技术，优化浙贝母加工工艺，即通过缩短热风干燥时间，降低能耗，同时解决了由于微波干燥失水速率过快而导致的浙贝母品质较差等问题，由于此法对设备要求高，目前尚未普及使用。硫黄熏制法是延长中药材保存时间的一种传统加工方法，具有外观增色，以及防腐、防蛀等优势，但硫黄熏制后，会导致浙贝母中的有效成分发生变化，而残留的硫黄成分对人体不利，此法已经逐渐被淘汰[22-23]。因此，还需进一步完善发展浙贝母的加工技艺。

通过调研发现，目前磐安县主要通过切片烘干方式对浙贝母进行加工。根据《中国药典》标准，贝母素甲和贝母素乙总量不得少于0.080%，水分不得超过18%。在磐安县调研的10个鲜样测定结果表明，贝母素甲和贝母素乙的总含量均超过0.080%，达到《中国药典》要求。但抽检的农户自行干燥的10个浙贝母干样里，有5个样品的贝母素甲和贝母素乙的总含量未达标，有些甚至只有《中国药典》所要求的一半。通过调研发现，部分农户会选择80 ℃左右的高温干燥浙贝母，以此缩短干燥时间，提高经济效益。由此推断，干燥温度可能是影响贝母素含量的一大因素。陈雪涛等[24]研究了不同温度干燥浙贝母，然后测定其贝母素甲和贝母素乙的含量，结果显示，60 ℃热风干燥浙贝母中活性成分含量最高，80 ℃干燥虽然用时短，但活性成分较低，因此，60 ℃热风干燥是浙贝母的最佳干燥温度，这与本试验一致。金玉琴等[25]研究表明，由于浙贝母生物碱不耐高温的因素，建议采用低温干燥技术加工浙贝母。值得注意的是，在达到《中国药典》标准的鲜样里，部分样品的贝母素甲和贝母素乙的总含量仍然偏低，这将影响外界对磐安县浙贝母品质的评价。

产地环境等条件是道地药材品质的重要外在因素，会直接影响到道地药材的生长发育及其有效成分的形成和积累[26]。宋林强[27]研究表明，不同施钾量下浙贝母生物量、产量存在显著差异，这说明土壤肥力对浙贝母的有效成分有着明显的影响。近年来，鸡粪作为农家肥的替代品，作为浙贝母的肥料广泛应用。卢晓等[28]试验发现，以有机鸡粪作基肥有利于提高浙贝母的产量，但高肥不利于有效成分的积累，菇渣覆盖有助于提升贝母素甲和贝母素乙的含量。综合考虑产量和质量，提出把有机鸡粪+菇渣的组合推荐作为生产上的施肥措施。

磐安县浙贝母质地优良，粉性足，深受国内外客商的欢迎。浙贝母的品质下降将影响磐安县浙贝母产业的长远发展，应引起高度重视，而树立磐安县作为“中国药材之乡”的新形象，提高道地药材质量就显得尤为重要。贝母素甲和贝母素乙是浙贝母药材中的主要活性生物碱，其含量易受干燥温度和产地环境的影响。为了提高磐安县浙贝母的品质，建议尽量避免散户单独干燥处理，选择合适的烘干温度进行集中加工、规范化管理，同时采用合理的施肥措施，确保浙贝母有效成分的形成和积累。