猪肺炎支原体中空纤维膜浓缩纯化工艺研究

车巧林 董彦鹏 耿晓眉 郁伟军 徐 凤

（江苏南农高科技股份有限公司，江苏江阴 214400）

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhyo）是引起猪支原体肺炎的主要病原。猪支原体肺炎除引起猪的生长受阻和饲料转化率降低外，重要的是它能破坏猪呼吸道黏膜纤毛屏障，从而引起多种病原的继发感染和混合感染，引起猪呼吸道疾病综合征，给世界养猪业造成严重的经济损失。

疫苗在疾病预防中的地位日益重要，因此对疫苗质量的要求也日益提高。在传统和新型疫苗的制备中，应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力、降低副反应的有效手段。疫苗纯化过程中常使用的方法有连续离心、沉淀、过滤、萃取、超速离心、微滤、超滤、层析等。传统的离心、过滤、萃取和沉淀技术目前更多的是作为整个疫苗分离纯化工艺的起始步骤，用于初步提纯；而后期的超速离心、微滤、超滤、层析技术等方法则进一步提高目标产物的纯度，使其达到疫苗行业标准。

中空纤维超滤是超滤技术中最为成熟与先进的一种技术，它采用切向流过滤，即液体流动方向与过滤方向垂直。与传统的液体死端过滤相比，切向流过滤具有滤速快、效率高、不易堵塞的优点，而且可根据需要控制浓缩和洗滤倍数，因此，在生物制品的生产中广泛应用。猪肺炎支原体大小200 nm左右，不适合采用超速离心和层析技术分离，因此选择超滤技术对其进行浓缩纯化。本研究初步建立了猪肺炎支原体中空纤维浓缩纯化工艺，并对猪肺炎支原体灭活菌液进行浓缩纯化，获得了较好的效果。

1 材料

1.1 菌株

猪肺炎支原体HN0613株（代次F6），由江苏南农高科技股份有限公司鉴定并保存。

1.2 主要试剂及仪器

Friis基础液及Friis培养基由江苏南农高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）购自 Sigma Aldrich 公司；无水硫代硫酸钠购自Alfa Aesar公司。

300 kD、500 kD、750 kD中空纤维超滤柱、0.1 µm中空纤维微滤柱购自GE公司。猪肺炎支原体微量间接血凝（IHA）检测试剂盒由江苏南农高科技股份有限公司自制；50 L发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司，超滤系统购自利穗科技有限公司。

1.3 试验动物

1～1.5kg日本大耳白兔，猪肺炎支原体IHA抗体阴性（效价＜1：5），购自苏州湖桥生物科技有限公司。

2 方法

2.1 猪肺炎支原体菌液的制备

猪肺炎支原体HN0613株冻干菌种用Friis培养基溶解，以10%比例接种于Friis培养基，37 ℃ 静置培养，pH 6.7～6.8时收获。收获菌液以5%比例传代两次后再以4～5%的比例接种发酵罐，通气量设置为0.8 Nm3/h，罐压维持0.06 MPa，37℃培养2～4d，待pH下降至6.7～6.8时收获，收获菌液进行无菌检验及CCU测定。

2.2 中空纤维膜孔径大小的选择

使用300 kD、500 kD、750 kD和0.1 µm的中空纤维膜分别对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，剪切速率控制在3 000 s-1，跨膜压TMP控制在0～10 psi，将抗原浓缩5倍后用无菌PBS进行动态平衡洗滤。每次洗滤液取1mL用于总蛋白含量测定。

2.3 纯化过程中洗滤液的选择

使用750 kD的中空纤维膜对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，剪切速率控制在3 000s-1，跨膜压TMP控制在0～10 psi。第一次纯化，抗原浓缩5倍后用无菌PBS动态洗滤5次；第二次纯化，抗原浓缩5倍后用无菌不含猪血清的Friis基础液（以下简称Friis基础液）动态洗滤5次。浓缩、纯化过程中的透过液和洗滤液均取1 mL用于CCU测定。

2.4 纯化过程中剪切速率的选择

使用750 kD中空纤维膜对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，剪切速率分别控制在1000 s-1、2 000 s-1、4 000 s-1、6 000 s-1和8 000 s-1，跨膜压TMP控制在0～10 psi，抗原浓缩5倍后用Friis基础液动态洗滤5次，收集过程中计算通量，并对最后收获的截留液进行CCU测定。

2.5 猪肺炎支原体灭活菌液的浓缩纯化

猪肺炎支原体活菌液经终浓度0.4 mM BEI灭活，10 mmol/L硫代硫酸钠终止后，取少量进行灭活检验，检验合格后用于纯化。

使用0.1µm中空纤维膜对猪肺炎支原体灭活菌液进行浓缩纯化，剪切速率控制在4 000 s-1，跨膜压TMP控制在0～10 psi，将抗原浓缩5倍后用Friis基础液洗滤7次，每次洗滤取30ml洗滤液。通过SDS-PAGE分析猪肺炎支原体灭活抗原纯化前及浓缩纯化过程洗滤液蛋白图谱，BCA法测定纯化前及浓缩纯化过程中总蛋白含量。

2.6 猪肺炎支原体灭活菌液纯化前后免疫原性测定

猪肺炎支原体纯化洗滤3次、5次和7次的收集液先分别稀释5倍恢复至原液，然后连同猪肺炎支原体纯化前灭活菌液与Gel佐剂分别乳化配苗，免疫1～1.5kg猪肺炎支原体IHA抗体阴性的健康日本大耳白兔，每组免疫5只，每只后腿肌肉注射疫苗0.5 ml。免疫后14d，以相同剂量和途径进行二免，剩余5只不免疫作为阴性对照。二免后28d，所有兔子采血、分离血清，IHA检测兔血清中猪肺炎支原体抗体效价，评判纯化过程中经不同次数洗滤猪肺炎支原体免疫原性是否受到影响。

3 结果

3.1 猪肺炎支原体菌液的制备

50 L发酵罐培养的猪肺炎支原体菌液无菌检验合格，CCU测定结果为109CCU/ml。

3.2 中空纤维膜孔径大小的选择

通过BCA法测定纯化前及各个孔径中空纤维膜浓缩纯化过程中收集液的总蛋白含量，以此计算杂蛋白去除率，结果见表1。猪肺炎支原体活菌液经300 kD、500 kD、750 kD和0.1µm中空纤维膜浓缩5倍、洗滤5次后杂蛋白去除率分别为63.57%、70.79%、81.27%和86.10%，由此看出750 kD和0.1 µm中空纤维膜纯化效果较好，蛋白去除率达80%以上。

3.3 纯化过程中洗滤液的选择

通过对比无菌PBS和Friis基础液两种洗滤液浓缩、纯化过程中透过液、收集液的CCU，评判浓缩纯化过程中猪肺炎支原体的回收率，结果见表2。从表中可以看出猪肺炎支原体活菌液经750 kD中空纤维膜浓缩5倍后CCU是浓缩前的5倍，且浓缩及纯化过程中透过端没有检测到CCU，但是用PBS洗滤时随着洗滤次数的增加猪肺炎支原体的CCU在降低，洗滤5次后CCU仅为105，而用Friis基础液洗滤5次猪肺炎支原体CCU仍为浓缩前的5倍，5×109，这说明纯化时用Friis基础液洗滤，活菌液回收率远远高于PBS洗滤时的活菌液回收率。

表1 Mhyo菌液经不同孔径中空纤维膜浓缩纯化过程中总蛋白含量及杂蛋白去除率

表2 纯化过程中不同洗滤液洗滤对Mhyo活菌液CCU和抗原回收率的影响

3.4 纯化过程中剪切速率的选择

使用750 kD的中空纤维膜对猪肺炎支原体活菌液进行浓缩纯化，不同剪切速率下的通量及截留液猪肺炎支原体CCU见表3，从中可以看出剪切速率在2 000 s-1以上时，通量可以达到20 L/h以上，适合生产中抗原的大量处理，但是当剪切速率达到8 000 s-1时，猪肺炎支原体活菌液CCU降到108，因此猪肺炎支原体纯化过程中剪切速率应控制在2 000～6 000s-1。

表3 不同剪切速率下的通量及Mhyo活菌液CCU

3.5 猪肺炎支原体灭活菌液的浓缩纯化

使用 0.1 µm中空纤维膜对猪肺炎支原体灭活菌液进行5倍浓缩，并用Friis基础液洗滤7次，收集浓缩液及洗滤液，通过SDS-PAGE分析猪肺炎支原体灭活菌液纯化前及浓缩纯化过程中蛋白图谱，BCA法测定纯化前及浓缩纯化过程中总蛋白含量，以此判断和计算杂蛋白去除率，结果见图1和表4。从图1可以看出洗滤4次后杂蛋白明显减少，从表4可以看出猪肺炎支原体灭活菌液经0.1 µm中空纤维膜浓缩5倍、洗滤7次后杂蛋白去除率可以达到94.66%。

图1 Mhyo灭活菌液纯化前及纯化过程中洗滤液SDS-PAGE；

表4 Mhyo灭活菌液浓缩纯化（0.1 μm）过程中总蛋白含量及杂蛋白去除率（BCA法）

3.6 猪肺炎支原体灭活菌液纯化前后免疫原性测定

猪肺炎支原体纯化洗滤3次、5次和7次的收集液，猪肺炎支原体纯化前灭活菌液与Gel佐剂分别乳化配苗，免疫1～1.5 kg猪肺炎支原体IHA抗体阴性的健康日本大耳白兔，二免后28天采血分离的兔血清用IHA测定猪肺炎支原体抗体效价，结果见表5，从表中可以看出，猪肺炎支原体灭活菌液浓缩5倍洗滤7次，猪肺炎支原体平均效价与浓缩前相比没有明显差异，说明猪肺炎支原体经0.1 µm的中空纤维膜浓缩纯化仍能保持良好的免疫原性。

表5 Mhyo灭活菌液纯化前及纯化过程中免疫原性（抗体效价）变化

4 讨论

随着社会科技的日新月异，膜在生活科技领域的应用不断扩大并发挥至关重要的作用。在膜分离领域中，超滤、微滤是两种应用最为广泛的膜过程，主要用于化工分离与精制、废水处理、膜生物反应器等。中空纤维膜具有比表面积大、产量高、便于加工制作、造价低、易于维护管理等优点，因此得到了广泛的应用和研究。现阶段，中空纤维超滤膜广泛应用于酶提纯与分级、中药制剂的制备、抗生素的浓缩与精制、疫苗的浓缩与纯化、菌体的去除，地表水、饮用水、废水处理等分离过程。

超滤技术在疫苗纯化领域首先应用在重组乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg上，早在1989年，Youn和Samanta用超滤膜对HBsAg哺乳动物细胞培养液进行10倍浓缩，随后通过聚乙二醇沉淀、凝胶过滤柱层析、KBr密度超离心和蔗糖密度梯度超离心获得纯度大于98%的HBsAg。1992年，Chai等应用截流量100kD的中空纤维超滤膜对含有HBsAg的酶解液进行了浓缩纯化，回收率高达97.7%，用该方法获得的抗原制备的B型乙肝疫苗用于儿童疫苗接种，抗体阳性转化率为100%，且重组疫苗质量高于从乙肝病毒携带者血液中提取乙肝表面抗原制成的疫苗。2012年，胡业勤等采用中空纤维超滤法纯化脱毒后的无细胞百日咳抗原，并与透析法进行了对比，结果显示超滤法去除无细胞百日咳抗原溶液中脱毒剂和色素的效率更高，3 h内即可完成，且所得原液的回收率为92.1%，接近透析法的回收率，原液效价为11.166 IU/ml，高于透析法获得的原液效价9.211 IU/ ml。本研究对猪肺炎支原体菌液进行了中空纤维超滤膜浓缩纯化工艺摸索，确定了超滤膜孔径大小、洗滤液及剪切速率，并对灭活菌液进行浓缩纯化，测定了杂蛋白去除率，以及浓缩前后猪肺炎支原体免疫原性的变化，结果表明应用中空纤维膜对猪肺炎支原体进行浓缩纯化可以获得满意的效果，考虑到大规模生产中抗原处理量大，建议疫苗生产中使用0.1 µm微滤膜。