荧光分光光度法测定酵母粉中维生素B6的含量

洪石，韦文美，贺品玉

（安徽医科大学基础医学院化学教研室，安徽合肥230032）

维生素 B6（Vitamin B6，VB6）又称吡哆素，是一种水溶性维生素，是机体内许多重要酶系统的辅酶，参与多种代谢反应，是人体正常发育必需的营养成分[1]。临床上应用维生素B6制剂防止妊娠呕吐和放射病呕吐[2]。长期缺乏维生素B6除了会导致皮肤、中枢神经系统的损害外，还可能引起人体免疫功能受损和造血系统损伤（低色素小细胞性贫血）[3-4]，此时需要适量补充维生素B6。

目前，对维生素B6的测定方法主要有紫外可见分光光度法[5]、高效液相色谱法[6-8]、荧光分光光度法[9]、激光全息干涉法等[10-12]，其中荧光分光光度法由于灵敏度高、选择性好、操作简单等特点而被广泛应用于食品、药品及环境检测中。本文采用荧光分光光度法建立了一种测定酵母粉中维生素B6的新方法。

1 试剂和仪器

柠檬酸（C6H8O7），柠檬酸钠（C6H5Na3O7），磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸二氢钠（NaH2PO4），硼酸（H3BO3），硼砂（Na2B4O7·10H2O），曲拉通-100，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），聚乙二醇，辛基硫酸钠（SOS），均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；维生素B6标准样品，国药集团化学试剂有限公司；安琪儿酵母粉，市购；蒸馏水，自制。

分析天平，高速离心机，上海精密仪器有限公司；荧光分光光度计，Cary Eclipse公司。

2 实验方法

2.1 缓冲溶液的配制

分别配制pH 3～6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、pH为7～8的磷酸-磷酸钠缓冲溶液、pH为8～9的硼酸-硼酸钠缓冲溶液，备用。

准确称取0.100 8 g维生素B6溶解，定容于100 mL容量瓶，配制成维生素B6标准溶液，备用。

2.2 维生素B6的荧光性质

将激发狭缝和发射狭缝分别设置为2.5 nm和10 nm，扫描速度设置为1 200 nm/min。用2 mL维生素B6溶液，以λem=390 nm为发射波长，在290～380 nm波长范围内扫描激发光谱，找出最大激发波长λex；以λex=326 nm为激发波长，在340～450 nm范围内扫描荧光光谱，找出最大发射波长λem=395 nm，如图1所示。

图1 维生素B6的荧光光谱和激发图谱（内）

2.3 实验条件的优化

2.3.1 缓冲溶液的影响

往10个25 mL容量瓶中分别加入2.00 mL维生素B6标准溶液，再分别往其中加入pH 为3.0、4.0、5.0、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0、8.4、9.0的缓冲溶液2.00 mL，蒸馏水定容至25 mL，以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm处分别测其荧光强度，如图2所示。

图2 缓冲溶液对维生素B6荧光强度的影响

图2 表明，pH=7.0时维生素B6的荧光强度最强。取两个25 mL棕色容量瓶，分别加入2.00 mL标准维生素B6溶液，一个加入pH=7.0的缓冲液2.00 mL，另一个不加，蒸馏水定容，以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm测其荧光强度，如图3。结果表明，pH=7的缓冲溶液能够最大程度增加荧光强度。

图3 不同波长对维生素B6荧光强度的影响

2.3.2 表面活性剂对维生素B6荧光强度的影响

取4个25 mL棕色容量瓶，分别加入2.00 mL维生素B6标准溶液和2.00 mL pH=7.0的缓冲溶液，然后依次往其中加入0.20 mL曲拉通-100、聚乙二醇、CTAB和SOS，蒸馏水定容，摇匀，以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm测其荧光强度，如图4。结果表明，选择的这四种表面活性剂对维生素B6的荧光强度几乎无影响，可起到稳定作用。

图4 不同表面活性剂对维生素B6荧光强度的影响

2.3.3 时间对维生素B6荧光强度的影响

往25 mL棕色容量瓶加入2.00 mL维生素B6标准溶液和2.00 mL pH=7.0的缓冲溶液，然后加入0.20 mL曲拉通-100，蒸馏水定容，摇匀，从2 min起，每隔2 min以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm测一次荧光强度，到第20 min结束，如图5所示。结果表明，随着时间的增加，维生素B6的荧光强度几乎没变化，趋于稳定。

图5 时间对维生素B6荧光强度的影响

2.3.4 维生素B6标准曲线的绘制

取9个25 mL的棕色容量瓶，分别加入维生素B6标准溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.40 mL、1.60 mL、1.80 mL，磷酸-磷酸钠缓冲液2.00 mL，曲拉通-100 0.2 mL，蒸馏水定容，摇匀，以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm测其荧光强度，做标准曲线，如图6。

图6 维生素B6的标准曲线

结果表明，在8.06×10-6～7.25×10-5g/mL范围内，荧光强度F与浓度c呈良好的线性关系，换算成浓度的标准曲线方程为F=9.89×106c+155.139 17，相关系数为0.990 1，表明该方法符合含量方法学验证的要求。

2.3.5 回收率实验

按表1进行回收率实验，结果表明回收率良好。采用该方法测定维生素B6的含量准确度高，含量可控。

表1 回收率实验结果

2.3.6 酵母粉中维生素B6含量的测定

准确称量酵母粉10.02 g放置于烧杯中，加入蒸馏水溶解，然后用离心机离心，取上清溶液，蒸馏水定容至25 mL，以λex=326 nm为激发波长，在λem=395 nm测其荧光强度，带入其标准曲线方程，最终得到酵母粉中维生素B6的含量为0.41%，与标示量相符。

3 结论

本实验阐述了pH、表面活性剂、时间对维生素B6荧光强度的影响，结果表明，加入pH为7.0的缓冲液和适量曲拉通-100可以增加维生素B6溶液的荧光强度。在优化的实验条件下，建立了维生素B6的标准曲线，应用该法成功地、不经分离地测定出了酵母粉中维生素B6的含量，方法快速、灵敏、简单、可靠。