响应面优化水–乙醇法提取云南咖啡生豆绿原酸工艺研究

杨剀舟，翟晓娜，栾 霞，郭咪咪，李秀娟，段章群✉

（1. 国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037；2. 农业部规划设计研究院，北京 100121）

绿原酸是由肉桂酸（咖啡酸、阿魏酸以及香豆酸）和奎宁酸酯化所形成的一类酚酸类化合物，是植物在有氧呼吸过程中经桂皮酸途径所产生的一类苯丙素类化合物[1]，具有良好的生理活性，有抗氧化、抗菌抗炎、抗高血压、保护心血管和调节糖脂代谢等生理功能[2-6]。绿原酸在自然界中广泛存在，其中在咖啡、金银花和杜仲中含量相对较高，绿原酸在阿拉比卡和罗布斯塔咖啡生豆中含量分别为3.4%～4.8%和7.9%～14.4%[7]。云南作为我国咖啡的主产区，其种植和产量占全国的98%以上[8]，从云南咖啡豆提取绿原酸不仅原料来源丰富，而且可以大大提高咖啡豆的附加值，对于国内咖啡产业提质增效具有重要意义。

常见的绿原酸单体主要包括6种咖啡酰奎宁酸，分别是3-咖啡酰奎宁酸（3-CQA）、4-咖啡酰奎宁酸（4-CQA）、5-咖啡酰奎宁酸（5-CQA）、3,4-双咖啡酰奎宁酸（3,4-DICQA）、3,5-双咖啡酰奎宁酸（3,5-DICQA）和 4,5-双咖啡酰奎宁酸（4,5-DICQA），以及3种阿魏酸奎宁酸，分别是3-阿魏酰奎宁酸（3-FQA）、4-阿魏酰奎宁酸（4-FQA）与5-阿魏酰奎宁酸（5-FQA）[7]。单咖啡（阿魏）酰奎宁酸（CQA和FQA）易溶于水、醇和丙酮等试剂，而双咖啡酰奎宁酸（DICQA）则易溶于乙醚、三氯甲烷等非极性溶剂中[9]，因此提取溶剂的选择较为重要。目前国内外对于绿原酸的提取研究大多集中在水提法[10]、醇提法[11]、水–乙醇法[12]、超声法[13]、微波法[14]、酶法[15]、超高压法[16]等，但是从实际生产操作来看，超声法、微波法、酶法以及超高压法等提取方法存在着设备投入大、应用成本较高以及大多仍处于实验室阶段等问题。水提法和醇提法由于单溶剂体系溶剂极性的限制，并不能将9种绿原酸单体完全有效的萃取出来；此外目前研究报道中大多只研究单一绿原酸单体（5-CQA）的提取[17-18]，忽视了其余8种绿原酸异构体提取变化规律，从而造成了物料的浪费和成本的提升。

基于上述原因本文选用云南卡蒂姆咖啡生豆为原料，以高效液相色谱对9种绿原酸异构体进行分析，首先采用水–乙醇法对绿原酸的提取工艺进行研究，并结合水提法进行对比，然后采用响应面法优化水–乙醇法咖啡生豆提取工艺，目的是获得水–乙醇法提取咖啡生豆绿原酸的最佳工艺，为云南咖啡豆的综合开发利用和咖啡产业提质增效提供一条重要途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卡蒂姆咖啡豆，品种阿拉比卡：购买于云南普洱；绿原酸标准品 5-CQA（≥98%）：美国Sigma-Aldrich公司；3-CQA、4-CQA、3-FQA、4-FQA、5-FQA、3,4-DICQA、3,5-DICQA、4,5-DICQA（≥98%）：成都普瑞法科技开发有限公司；亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）、二水合乙酸锌（CH3COO）2Zn·2H2O）：国药集团化学试剂有限公司；甲酸，乙醇，乙腈等试剂为色谱纯。

1.2 仪器与设备

R220咖啡研磨机：日本皇家富士；LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津；自动进样器：日本岛津 SIL-20AC；TGL-20M 高速离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；超纯水制备机器：美国Milli-Q；恒温水浴锅：电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 单因素实验

1.3.1.1 物料目数对绿原酸提取率的影响 称取物料目数分别为 20、40、60、80、100目下的咖啡粉 10.0 g按照液料比 20∶1加入超纯水，在90 ℃水浴中提取15 min，考察不同物料目数对绿原酸提取率的影响。

1.3.1.2 液料比对绿原酸提取率的影响 称取物料目数为60目的咖啡粉10.0 g，分别按液料比为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入去离子水，在90 ℃水浴中提取15 min，考察液料比对绿原酸提取率的影响。

1.3.1.3 水提温度对绿原酸提取率的影响 称取物料目数为 60目的咖啡粉 10.0 g，按照液料比20:1加入去离子水，分别在60、70、80、85、90、95、100 ℃下提取咖啡豆中绿原酸15 min，考察水提温度对绿原酸提取率的影响。

1.3.1.4 提取时间对绿原酸提取率的影响 称取物料目数为 60目的咖啡粉 10.0 g，按照液料比20∶1加入去离子水，在90 ℃下分别提取咖啡豆中绿原酸5、10、15、20、25 min，考察提取时间对绿原酸提取率的影响。

1.3.1.5 醇浓度对绿原酸提取率的影响 根据文献报道乙醇–水的混合溶剂最佳提取温度为60 ℃。称取物料目数为60目的咖啡粉10.0 g，在液料比1∶20，在60 ℃下以混合溶剂中醇浓度分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%对咖啡豆中绿原酸进行提取15 min，考察不同乙醇浓度对绿原酸提取率的影响。

1.3.2 响应面实验设计

1.3.3 绿原酸分析检测

1.3.3.1 绿原酸待测液的制备 按照上述条件来制备咖啡提取液，在5 000 rpm下离心5 min；取上层滤液4 mL，加入100 μL CarrezⅠ试剂（亚铁氰化钾，250 mmol/L），100 μL CarrezⅡ试剂（二水合乙酸锌，1 mmol/L），800 μL甲醇，充分震荡混匀，静置10 min以沉淀蛋白；最后5 000 rpm，10 min离心取上层液过膜置于4 ℃冰箱备用[19]。

1.3.3.2 液相色谱条件 色谱柱为 C18反相柱(250 mm×4.6 mm, 4 μm，孔径 80 Å )，流动相 A为超纯水，流动相B为1%甲酸–乙腈，紫外检测波长325 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0 min时，流动相A和B比例95:5；线性增加到60 min时，流动相A和B比例75:25；自动进样器设置为4 ℃，进样量10 μL[20]。咖啡生豆绿原酸组成液相色谱图如图1所示。

绿原酸提取率（%）计算公式如下所示：

1.3.3.3 绿原酸标准曲线的绘制 称取绿原酸（5-CQA）标品1.000 g置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到10 mg/mL的标品储备液。吸取储备液0、100、200、300、400、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 μL 分别置于7个10 mL容量瓶中，用甲醇定容混匀，配成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的11个不同浓度的标准溶液，按照1.3.3.2中的色谱条件依次进样10 μL测定峰面积。以峰面积为纵坐标，绿原酸标品溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。计算得线性回归方程为：y= 33 275 600x–12 342（R2= 0.999 8）。结果表明，在 0.1 ～3.0 mg/mL范围内，峰面积与浓度线性关系良好（如图2所示）。

图1 咖啡豆绿原酸液相色谱图

图2 绿原酸标准曲线

1.3.4 数据分析

所有实验平行测定3次，采用SPSS（Vision 22.0，IBM）和Design-Expert 8.05软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 物料目数

由图 3中可以看出，随着物料目数的增加，咖啡生豆的绿原酸提取率呈现先线性增加后基本不变的趋势，在60目时提取率基本达到平衡，约为4.0%，主要原因是在20～60目过程中，在提取传质过程中与水接触比表面积越大，绿原酸越易溶解出来；当溶剂和溶质传质达到平衡时，绿原酸就不再渗透溶解出来，因此提取率基本不再变化。Rohit Upadhyay等[14]采用物料目数大于25目（＜720 μm＝的罗布斯塔咖啡生豆粉在微波功率800 W、提取温度50 ℃、微波时间10 min下的绿原酸提取率为 6.35%，主要原因是作者采用醋酸铅沉降法测定绿原酸含量会造成测定结果偏高，此外罗布斯塔豆绿原酸含量相对高于阿拉比卡豆。综合考虑，选择物料目数60目进行绿原酸提取率的下一步研究。

图3 物料目数对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

2.1.2 液料比

由图4中可以看出，随着液料比的逐渐增加，咖啡生豆的绿原酸提取率呈现先增加后基本不变的趋势，在液料比20∶1时提取率基本达到平衡，与饶建平等[10]报道的结论一致。酚类物质的提取在一定程度上与溶剂和溶质的比例有关，当传质平衡时溶解到溶剂中的溶质不再变化，进一步提高传质效率还要考虑溶剂的类型，一般来讲极性和非极性共存的混合溶剂提取效率更高，后续我们将会对醇浓度对于提取率的影响进行研究。综合考虑，选择液料比20∶1进行绿原酸提取率的下一步研究。

图4 液料比对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

2.1.3 水提温度

由图 5中可以看出，随着水提温度的逐渐增加，咖啡生豆的绿原酸提取率呈现先增加后下降的趋势，在95 ℃时达到最大，约为4.30%。在绿原酸提取过程中，随着温度的增加，传质扩散系数急剧增加，绿原酸大量从咖啡细胞中溶出，使得绿原酸提取率直线增加；当温度达到 100 ℃时，绿原酸由于存在大量的酯键、双键和酚羟基基团，在长时间处于高温下时易发生分解、氧化和异构化等变化，导致提取率降低。有研究报道[10]当温度 90 ℃时，绿原酸提取率就开始降低，与我们的研究结果一致，但我们的研究在 95 ℃时绿原酸的提取率又出现了升高，这可能的原因是1个双咖啡酰奎宁酸的降解成 2个单咖啡酰奎宁酸，增加了绿原酸的整体含量。综合考虑，选择水提温度95 ℃进行绿原酸提取率的下一步研究。

图5 水提温度对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

2.1.4 提取时间

由图 6中可以看出，随着提取时间的逐渐增加，咖啡生豆的绿原酸提取率在5～15 min内随着时间的增加而增加，而在15～30 min内随着时间增加则呈现缓慢下降的趋势。主要原因是绿原酸在咖啡细胞中和水溶液中的传质在15 min达到平衡以及长时间的高温提取导致绿原酸的氧化分解，因此在高温下的提取时间不宜过长。综合考虑，选择提取时间15 min进行绿原酸提取率的下一步研究。

图6 提取时间对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

综上所述，在纯水体系下，绿原酸提取率的较佳工艺为物料目数60目，液料比20∶1，水提温度95 ℃，提取时间15 min，绿原酸提取率为4.29%。

2.1.5 醇浓度

根据文献报道，提取溶剂中含有一定比例的乙醇可能会提高绿原酸的提取率，但是对于最佳绿原酸提取率的醇浓度比例并不一致[11-12,17-18]；同时乙醇-水的混合溶剂最佳提取温度大约在60 ℃[11,17]左右，因此我们在醇提温度60 ℃，物料目数 60目，液料比 20∶1，提取时间 15 min下对不同醇浓度对于绿原酸提取率进行了研究，结果如图7所示。

图7 醇浓度对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

从图中可以看出，从纯水到纯乙醇，绿原酸的提取率出现先增加后减少的趋势，其中醇浓度在20%～60%范围内提取率相差不大，40%时相对较高，为 5.21%，比纯水溶剂体系下提取率高约21%，比文献报道中的纯水体系和聚二乙醇体系（60 ℃，40%醇浓度）下[11,17]的提取率高60%和280%，主要原因在于报道中只研究了 5-CQA的提取率，此外纯水体系难以把弱极性的双咖啡酰奎宁酸萃取出来[20]；而在 80%和 100%高醇浓度时，绿原酸提取率只有 2%和 1.5%左右，与同温度下的纯水体系基本一致，并没有起到提高传质效率的目的，主要原因是混合溶剂的极性，作为绿原酸主要单体的5-CQA易溶于水，极性较大，而乙醇的极性小于水，在高醇体系下对于5-CQA的萃取量降低，从而造成提取率降低。

我们同时对文献报道中[11,17]的最佳醇提温度进行验证，结果如图8所示。研究发现与文献报道一致，在60 ℃时绿原酸提取率达到最高。

图8 醇提温度对咖啡生豆绿原酸提取率的影响

综上所述，在单因素实验中，绿原酸较佳的提取工艺条件为：醇提温度60 ℃，醇比例40%，物料目数60目，液料比20∶1，提取时间15 min，绿原酸提取量为5.21%。

2.2 响应面实验

2.2.1 响应面设计及结果

在单因素实验的基础上，采用Design-Expert 8.05软件进行响应面设计，根据 Box-Behnken（BBD）中心组合设计原理，选取提取时间A、液料比B和醇浓度C三个对绿原酸提取率影响显著的因素作为自变量，以绿原酸提取率为响应值，设计3因素3水平的响应面实验，研究提取时间、液料比和醇浓度对生豆中绿原酸提取率的影响。实验因素水平表与实验结果如表1～2所示。

表1 响应面设计因素水平表

表2 绿原酸提取响应面实验设计及实验结果

采用Design-Expert 8.05软件对表2中绿原酸提取率的实验数据进行多元回归拟合，得到绿原酸提取率对自变量A、B、C的二次多项式回归方程：

Y=5.22–0.045A–0.16B–0.26C–0.055AB+0.35A C+0.16BC–0.41A2–0.26B2–0.35C2

回归方程方差分析和回归方程系数显著性检验见表 3。由表 3可知，绿原酸提取率模型的判定系数R2=0.975 7，P＜0.000 1，此模型高度显著，绝对平均偏差（4.74%）也相对较低，说明模型预测结果的重复性良好；此外较高的调整判定系数（0.944 4）和失拟项不显著（0.051 3）也说明了不确定因素对实验结果的干扰较小，模型拟合程度良好，此模型能很好解释绿原酸提取率响应值的变化，可以用于预测绿原酸提取过程中实际情况。模型回归方程系数显著性检验表明，一次项系数B和C即液料比和醇浓度对生豆绿原酸提取率影响都显著，交互项AC、BC和二次项A2、B2、C2对生豆绿原酸提取率具有显著性影响。

表3 生豆绿原酸提取率回归方程方差分析表

2.2.2 响应面分析

图9表示的是固定液料比为20∶1下，提取时间和醇浓度及其交互作用对绿原酸提取率的影响。最大的绿原酸提取率出现在提取时间为10～14 min和醇浓度20%～28%范围内，随着提取时间和醇浓度的增加，绿原酸提取率出现先升高后下降的趋势，这与陈魏[22]等的研究结论相一致。

图9 提取时间和醇浓度及其交互作用对绿原酸提取率的影响

图10表示的是提取时间为15 min下，液料比和醇浓度及其交互作用对绿原酸提取率的影响。最大的绿原酸提取率出现在液料比为15∶1～19∶1和醇浓度20%～28%范围内，随着液料比和醇浓度的增加，绿原酸提取率出现先升高后下降的趋势，液料比的增加不但会造成提取时间和醇浓度的增加，还会造成绿原酸提取率的降低。这与唐薇[23]和饶建平[10]等的研究结论相一致，主要原因可能是在水醇体系下，随着液料比的增加，体系中其他物质随之溶出，与绿原酸产生了竞争性溶出现象；而在高醇体系下由于混合溶剂的极性降低，造成绿原酸主要单体的5-CQA溶解度降低，因此造成绿原酸得率降低。

图10 液料比和醇浓度及其交互作用对绿原酸提取率的影响

2.2.3 反应条件优化及模型验证

以绿原酸提取率作为响应值，通过响应面软件对水–乙醇法提取绿原酸实验数据最优化分析，考虑到实际生产中成本和溶剂损耗，最终得到最佳提取时间11.67 min，液料比16.07∶1，醇浓度20.16%，绿原酸提取率5.27%。

对上述最优化条件进行 3次平行验证实验，绿原酸提取率分别为5.30%、5.35%和5.29%, 平均得率 5.31%。实验值和预测值具有良好的相关性, 说明该响应面模型和最优化条件是有效的。

3 结论

以云南卡蒂姆咖啡豆为原料，采用水–乙醇法首次对9种绿原酸异构体进行提取研究。通过单因素和响应面优化得到的水–乙醇法提取绿原酸的最佳工艺条件为：醇提温度 60 ℃，提取时间11.67 min，物料目数60目，液料比16.07∶1，醇浓度20.16%，绿原酸提取率5.31%。本研究对9种绿原酸异构体的提取效果进行研究，相比较先前研究只对5-CQA提取率进行研究，更能全面反映绿原酸的提取效果，绿原酸得率也更高。

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。