天然食用香料草莓酸对黄曲霉的抑菌作用研究

马卫宾✉，张 迪，谢岩黎，赵文红，孙淑敏

（河南工业大学粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001）

黄曲霉能够侵染谷物、干果、饲料等食品，并产生致癌性代谢产物黄曲霉毒素[1]，不仅造成食品质量劣变和经济价值损失，还严重影响人类及动物的健康[2]。据联合国粮食及农业组织统计，全世界大约有四分之一的谷物受到真菌及其毒素污染，导致巨大的经济损失，例如美国每年因为真菌毒素污染造成的损失约10亿美元[3]。我国是粮食生产大国，在粮食采收、储藏和运输等环节发生的黄曲霉毒素污染造成了很大的损失和危害[4-5]。因此，急需寻找安全有效的方法控制粮油食品中黄曲霉及其毒素的污染。尽管人工合成抑菌剂已经被广泛用于控制食品中的微生物污染，但有研究表明不合理地使用人工合成杀菌剂可能会对人类健康及环境产生潜在不良影响，包括降解周期长、毒性残留和耐药性[6-7]。目前，研发安全有效的天然抑菌剂代替传统的人工合成抑菌剂已成为食品领域的一个研究热点，其中植物源抑菌化合物由于具有安全性高等优点，已越来越受到重视[8-9]。

植物源有机酸作为防腐剂在食品中的应用已有上百年的历史，例如苯甲酸、肉桂酸及其衍生物[10]。王勇[11]等报道了 14种小分子有机酸对 6种植物病原真菌的抑菌活性，发现枯茗酸的抑菌活性最好，苯甲酸和肉桂酸次之。目前在食品领域常用的防腐剂多为有机酸及其盐类，其中山梨酸及其钾盐由于抑菌性能好，并且安全性高，是FAO和WHO推荐的食品防腐剂[12]。草莓酸（反式-2-甲基-2-戊烯酸）天然存在于草莓的香味成分中，是美国食用香料与天然提取物制造者协会（FEMA）认可的安全食用香料，也是我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014附录中允许使用的食用香料。草莓酸具有新鲜草莓香气，且带有甜润的浆果样香气和酸味，是配制草莓香精的主香原料。作为一种天然有机酸类食用香料，关于草莓酸抑菌活性的研究未见报道。本实验室在前期工作中对天然有机酸的抑菌活性进行了筛选，发现草莓酸活性较好，具有进一步研究的价值。在此基础上，本文以食品工业常用防腐剂山梨酸为阳性对照，评价了草莓酸对人工培养基和储藏花生中黄曲霉生长和侵染的控制作用，为将其开发成为天然、绿色、安全的食品防腐剂或粮食防霉剂提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓酸（纯度≥98%）：西亚化学科技有限公司；山梨酸（纯度≥99%）：上海麦克林生化科技有限公司（两种化合物的化学结构式见图 1所示）；黄曲霉菌：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。

图1 供试化合物结构式

察氏培养基：蔗糖30 g、硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、氯化钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；GZX-DH-400BS型电热恒温干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；MJ-250-I 霉菌培养箱：河南兄弟仪器设备有限公司；AL104电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄曲霉孢子悬浮液制备

将于-20 ℃保存的黄曲霉菌取出，静置至室温，于恒温培养箱（28±2）℃活化24 h后接种于察氏培养基培养6 d；无菌接种环刮取平板表面，并用 0.1%吐温80的水溶液洗脱，三层无菌擦镜纸过滤除去菌丝，制得孢子悬浮液；用血球计数板测定稀释至孢子悬浮液浓度为106～107个/mL[13]。

1.2.2 草莓酸对黄曲霉的离体抑菌活性测定

参照文献[14-15]中的方法并稍加改进，具体为：根据设定的抑菌实验所用梯度浓度，分别称取相应质量的草莓酸并将其溶于1 mL无水乙醇中，然后缓慢加入到4 mL 20%的吐温80水溶液中，充分涡旋至完全混匀，制得草莓酸测试母液；同样方法设置山梨酸阳性对照组（准备实验表明所用溶剂体系对供试菌种生长无影响，故正式实验不再设溶剂对照组）。用移液枪吸取1 mL测试母液滴加到无菌培养皿中与19 mL灭菌察氏培养基混匀，同时设空白对照组（20 mL灭菌察氏培养基），冷凝后备用。用移液枪吸取5 μL新鲜孢子悬浮液，接种至制备的培养基表面中间，（28±2）℃条件下培养8 d。每处理设置3个重复，十字交叉法测量菌落直径。按照以下公式计算抑菌率：

抑菌率(% ) = （dc-dt） /dc×100%

式中：dc为对照组中菌丝平均直径（cm）；dt为实验组中菌丝平均直径（cm）。

1.2.3 草莓酸对储藏花生中黄曲霉的抑菌活性

参照文献中的方法[7,16]并稍加改进，具体为：挑选颗粒饱满无霉菌污染的花生粒，用1%次氯酸钠溶液浸泡2 min消毒种子表面，无菌水冲洗干净后浸泡4 h调节水分含量，无菌环境下晾干花生粒表面水分备用。取1mL测试化合物母液（配制方法同1.2.2）加入到19 mL孢子悬浮液中充分混匀，立刻将经过消毒和水分调质的花生粒浸入到含药孢子悬浮液中并稍加搅拌，1 min后取出花生粒在无菌环境下置于灭菌滤纸上，每个浓度取14～16粒花生平放于培养皿中，用 Parafilm迅速密封，（28±2）℃条件下培养5 d。设置空白对照，每处理设置3个重复。以花生粒表面是否长出肉眼可见菌丝为标准，每隔24 h观察并统计受黄曲霉污染的霉变花生粒数量。按照以下公式计算霉变率：

花生霉变率(%)= C /T× 100%

式中：C为霉变花生粒数量（粒），T为花生粒总数量（粒）。

1.3 数据分析

采用Excel和Origin 8.5软件对数据进行分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 草莓酸与山梨酸对黄曲霉菌的离体抑菌活性

最小抑菌浓度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）是测定化合物抑菌活性的重要参数[17]。对比研究不同作用浓度及作用时间条件下，草莓酸与山梨酸对黄曲霉的离体抑菌活性，进而确定二者的MIC。图2-A表明，供试浓度梯度下，草莓酸与山梨酸均对黄曲霉生长显示出抑制效果，并且二者对黄曲霉生长的抑制作用呈浓度依赖性。通过对比图2-A数据可知，随着供试浓度的增大，草莓酸浓度达到0.6 g/L时，对黄曲霉生长抑制率为100%，而山梨酸在浓度达到1.0 g/L时，能够完全抑制黄曲霉的生长。由此可知二者对黄曲霉的MIC分别为0.6和1.0 g/L。根据图2-B的数据以及图2-C的实物照片，可以看出随着两种化合物作用浓度的增加，黄曲霉的生长受到抑制的程度逐渐加深；同时，随着培养时间的延长，黄曲霉菌丝生长的菌落直径不断变大，但与空白对照组相比，处理组黄曲霉菌落直径变化受到不同程度抑制，菌丝生长速率明显变慢，生长状况出现延迟。如草莓酸0.4 g/L、山梨酸0.8 g/L浓度下，培养8 d时的黄曲霉菌落大小与空白对照培养2 d的菌落大小相当，菌丝生长延迟了大约6 d。从以上结果可以看出，离体条件下草莓酸对黄曲霉的抑菌活性要优于食品工业常用防腐剂山梨酸。

2.2 草莓酸与山梨酸对储藏花生中黄曲霉的抑菌活性

基于草莓酸对黄曲霉的离体抑菌活性研究结果，进一步研究了草莓酸对储藏花生中黄曲霉生长的实际控制效果，并与山梨酸进行了对比。由图3-A可知花生霉变率随着草莓酸和山梨酸浓度的增加而逐渐降低。当其草莓酸浓度为 10.0 g/L时，能够完全抑制储藏花生中黄曲霉的侵染；草莓酸在5.0 g/L时能够使花生的霉变率降低50%以上。阳性对照山梨酸在浓度达到20.0 g/L时，能够完全抑制黄曲霉在花生上的生长；在 5.0～15.0 g/L浓度范围内，山梨酸能使花生霉变率有不同程度的降低。图3-C展示了培养5 d后不同浓度草莓酸和山梨酸处理对储藏花生霉变率影响的实物照片，可以看出空白对照组中的花生已经全部被黄曲霉污染，菌丝布满花生表面；而草莓酸和山梨酸能够有效控制黄曲霉对花生的侵染，使花生中的黄曲霉生长变缓，降低花生的霉变率。

根据图3-B的数据曲线变化趋势可以发现，当两种化合物作用浓度低于完全抑制浓度时，随着培养时间的延长，花生的霉变率逐渐增加；但与空白对照组相比，处理组花生霉变率的增长趋势明显变慢，花生发生霉变的时间出现不同程度的延迟。通过对比图3中的数据可知，草莓酸对花生中黄曲霉侵染的抑制效果要优阳性对照山梨酸。本研究结果表明草莓酸对黄曲霉具有良好的抑制活性，为研发新型有机酸类食品防腐剂提供了基础和参考，值得进一步深入研究。

图2 山梨酸与草莓酸不同作用浓度（A）、不同作用时间（B）对黄曲霉的离体抑菌活性及实物照片（C）

图3 山梨酸与草莓酸在不同作用浓度（A）及作用时间（B）条件下对花生储藏过程中黄曲霉的控制作用及实物照片（C）

草莓酸和山梨酸均为短链脂肪酸，二者有着相似的化学结构，但本研究发现草莓酸对黄曲霉的抑制活性优于山梨酸，这种活性上的差异可以在构效关系方面作进一步探讨。有研究人员通过对比研究 30余种饱和或不饱和脂肪酸对大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌活性，发现碳链长度、双键数目、双键位置以及取代基团的不同对其抑菌活性有非常大的影响[18]。宁正祥[19]等对含α,β-不饱和羰基化合物分子结构特性及其抗菌活性进行研究，发现这类防腐剂的抗菌活性与分子疏水性和分子最低空轨道能量有关。于辉[20]通过量子化学研究，表明 1,3-丁二烯的交替碳碳双键骨架对山梨酸的羧基提供有力的支持，羧基和C1的电子云密度较大，是山梨酸的抗菌活性中心。草莓酸的化学结构比山梨酸少一个碳碳双键，但在α碳位置多一个甲基，这种结构上的变化对抑菌活性的影响机理值得进一步研究，可为抑菌活性化合物的结构优化提供借鉴和启发。

3 结论

本研究以黄曲霉菌为供试菌种，并以山梨酸为阳性对照，采用生长速率法测定了天然食品香料草莓酸对黄曲霉菌的离体抑菌活性，并在实验室条件下评估了该化合物对储藏花生中黄曲霉菌的控制作用发现草莓酸的抑菌活性优于山梨酸。离体条件下草莓酸对黄曲霉的最小抑菌浓度为0.6 g/L，山梨酸为1.0 g/L。花生储藏防霉试验表明，草莓酸对储藏花生中黄曲霉侵染和生长的有效控制浓度为10.0 g/L，山梨酸在20.0 g/L时才能完全抑制黄曲霉在储藏花生中的生长。

尽管山梨酸、苯甲酸等防腐剂已在食品工业得到了广泛的应用，但仍有一些问题需要进一步解决。比如安全性问题，有些防腐剂对人体具有潜在毒性，如苯甲酸及其盐类具有一定的致突变作用和遗传毒性[21]。山梨酸比苯甲酸安全性更高，但山梨酸对霉菌、酵母生长具有较好抑制作用，对细菌作用却不强[22]。随着消费者对食品安全的要求越来越高，寻找和开发广谱、安全、高效的新型食品防腐剂已成为食品行业关注的研究热点[23]。本实验室近年来围绕天然食品防腐剂和粮食防霉剂进行了持续研究，并取得一些进展[24-25]。本研究选用的草莓酸存在于草莓的香味物质组分中，并且是一种天然食用香料，在安全性方面具有优势。后期可进一步研究草莓酸钠盐、钾盐的抑菌活性，并且扩大抑菌谱的筛选，为其实际应用提供基础和依据。

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。