甘草酸调控AMPK/ACC/SREBP信号通路改善胰岛素抵抗的机制

2020-10-15陈雪梅

生物加工过程 2020年5期

栾超，邵蕾，石惠，陈雪梅

(江苏卫生健康职业学院卫生管理与基础学院，江苏南京 211800)

胰岛素抵抗(IR)是指机体对胰岛素敏感性降低的一种病理状态，主要表现在胰岛素的靶组织(如肌肉、肝脏等)对胰岛素的反应性和敏感性降低，从而导致对葡萄糖的摄取和利用减少，常常伴有脂质分解障碍以及蛋白质合成受损等情况[1]。胰岛素抵抗既是引发代谢综合征、糖尿病和心血管疾病的高危因素，又是这些疾病共同的病理生理基础，给人类健康带来严重危害。

据统计，现代人过多摄入高热量食物，使肥胖的发生率明显增加[2]，而肥胖诱发高游离脂肪酸血症将会导致胰岛素抵抗[3]，尤其是腹型肥胖者更为高发。因此，本实验采用长期给予小鼠高脂饮食，诱导肥胖复制胰岛素抵抗模型，模拟能量摄入过多而造成的胰岛素抵抗，更加接近于人类饮食模式。

甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)为甘草的主要有效成分，是一种五环三萜系列皂苷，临床被广泛用作降血糖、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗急慢性肝炎、抗支气管炎及抗溃疡等方面[4]。Eu等[5]发现:甘草酸可以恢复胰岛素抵抗状态下脂蛋白脂酶的活性，调节血脂紊乱，但是其具体作用机制不明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是调节机体能量代谢的重要物质，研究表明：多种天然化合物能激活AMPK，增强胰岛素的敏感性，是改善胰岛素抵抗的潜在靶点。因此，本研究拟观察甘草酸对长期高脂饮食诱导的胰岛素抵抗的调控作用，并观察其对AMPK的影响，探究作用机制，以期为甘草酸的现代化应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6J雄性小鼠50只，体质量20～22 g，由南通大学动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2014-0001。

1.2 药物与试剂

甘草酸(纯度98%)，南京泽朗医药科技有限公司；胰岛素试剂盒，美国Sigma公司；AMPK一抗、磷酸化AMPK一抗、ACC一抗、磷酸化ACC一抗、SREBP一抗和GAPDH一抗，美国Cell Signaling Technology(CST)公司；PVDF膜，美国Millipore公司。

1.3 实验仪器

血糖仪，上海强生(中国)医疗器械有限公司；UniCel DxC800全自动生化仪，美国BECKMAN COULTER公司；H1650R型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；CX31型生物正置显微镜，日本OLYMPUS公司；Western SDS-Page电泳仪，美国Bio-Rad公司；MICROCHEMI化学发光凝胶成像仪，以色列DNR公司。

1.4 小鼠造模与给药

根据参考文献[6]造模，将小鼠随机分成5组：正常组(LC)、模型组(HF)、二甲双胍组(Met)、甘草酸低剂量组和甘草酸高剂量组，每组10只。除正常组外，其余组小鼠均给予高脂饮食，16周后，发现小鼠出现体质量增加，血脂和血糖升高，糖耐量和胰岛素耐量受损等胰岛素抵抗的特征，从而判定造模成功。随后给予相应药物干预，正常组和模型组则给予等量生理盐水灌胃。在药物干预16周后，取血，分离血清测定甘油三酯(TC)、总胆固醇(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；小鼠脱椎处死，取出肝脏固定用于免疫印迹分析。

1.5 糖耐量试验和胰岛素耐量试验

甘草酸干预第14周做糖耐量试验，试验前禁食12 h，小鼠尾部取血，使用血糖仪检测空腹血糖(Blood Glucose,BG)0 min。称量小鼠体质量，腹腔注射葡萄糖溶液2 g/kg，随后分别在30、60和120 min时间点取血，检测血糖值(BG 30 min，BG 60 min和BG 120 min)。

甘草酸干预第15周做胰岛素耐量试验，试验前禁食4 h，测空腹胰岛素水平，腹腔注射胰岛素0.75 U/kg，操作同糖耐量试验。

1.6 Western blotting技术检测肝脏AMPK、ACC和SREBP的表达

将小鼠肝脏组织用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取组织总蛋白，充分匀浆，4 ℃、12 000 r/min，离心 20min，收集上清液，BCA法进行总蛋白定量。采用SDS-PAGE凝胶电泳，每孔加入30 μg 蛋白，转至PVDF膜上，5%质量分数脱脂奶粉室温封闭1 h，置于AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤3次，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗室温下孵育1 h，用TBST缓冲液洗涤3次，化学发光凝胶成像系统发光成像。

1.7 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 甘草酸对高脂饮食诱导小鼠血脂的影响

甘草酸对小鼠血脂的作用结果见表1。由表1可知：模型组(HF)小鼠的TG、TC、LDL-C明显升高，HDL-C明显降低，与正常组(LC)相比，具有极显著差异(P<0.01)。与模型组(HF)相比，甘草酸高剂量组(HF+GA-100 mg/kg)和二甲双胍组(HF+Met-250 mg/kg)小鼠的TG、TC和LDL-C明显降低(P<0.05，P<0.01)，甘草酸低剂量组(HF+GA-50 mg/kg)小鼠TG明显降低(P<0.05)。由此可知，甘草酸和二甲双胍均能升高HDL-C水平，但没有统计学意义。甘草酸能够明显降低TG、TC和LDL-C，一定程度上能导致HDL-C升高，改善高脂饮食诱导的血脂紊乱。

表1 甘草酸改善高脂饮食诱导的血脂代谢紊乱

2.2 甘草酸改善高脂饮食诱导的糖耐量异常

甘草酸对小鼠血糖的影响见表2。由表2可知：所有小鼠的血糖均在30 min达到最高峰，经长期高脂饮食的小鼠与正常小鼠相比，各时间点的血糖均明显升高，具有极显著差异(P<0.01)。甘草酸高剂量组(HF+GA-100 mg/kg)和二甲双胍组(HF+Met-250 mg/kg)小鼠在0、30、60和120min的血糖均降低，与模型组(HF)小鼠相比都有显著差异(P<0.05，P<0.01)，而低剂量的甘草酸(HF+GA-50 mg/kg)作用并不明显(P>0.05)。由此可知，甘草酸高剂量能明显改善高脂饮食诱导的糖耐量异常。

表2 甘草酸改善高脂饮食诱导的糖耐量异常

2.3 甘草酸改善高脂饮食诱导的胰岛素耐量异常

甘草酸对小鼠胰岛素的影响见表3。由表3可知：与正常组(LC)相比，模型组(HF)小鼠在各个时间点的血清胰岛素水平明显升高，提示长期高脂饮食可造成小鼠胰岛素水平紊乱，胰岛素耐量异常。而二甲双胍(HF+Met-250 mg/kg)和甘草酸高剂量(HF+GA-100 mg/kg)均能明显降低各个时间点的小鼠血清胰岛素水平，疗效接近，与模型组(HF)相比，均具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)，甘草酸低剂量(HF+GA-50 mg/kg)能明显降低高脂饮食小鼠0和120 min时的胰岛素水平(P<0.05)，对30和60 min作用不明显。提示甘草酸能明显改善高脂饮食造成的胰岛素耐量异常，提高机体对胰岛素的敏感性。

表3 甘草酸改善高脂饮食诱导的胰岛素耐量异常

2.4 甘草酸对高脂饮食小鼠肝脏AMPK/ACC/SREBP信号通路的影响

AMPK即AMP依赖的蛋白激酶，作为细胞的“能量调节器”，广泛参与了机体能量的消耗及摄入，当AMPK被激活后，能明显增加胰岛素的敏感性，提高葡萄糖稳态水平，促进蛋白质和脂肪的合成，现已成为改善胰岛素抵抗的重要靶点[7]。有研究表明：进行体育锻炼、使用降糖药物(双胍类、噻唑烷二酮类等)，或者某些天然化合物均能激活AMPK，磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)，从而抑制ACC酶的活性，减少丙二酸单酰辅酶A的含量，继而减少脂肪酸的生物合成，并减少TG的合成，从而改善胰岛素抵抗状态[8]。

固醇调节元件结合蛋白(SREBP)，又被称为脂肪细胞定向分化因子，可能具有生脂作用。有研究表明：SREBP是调控脂肪酸、甘油三酯和胆固醇合成的关键因子[9]，而人类脂肪生成的能力主要就受SREBP表达的影响[10]。AMPK通过下调脂肪酸合成的相关酶的活性，可以通过抑制脂质生成有关的因子SREBP-1c、ChREBP的表达来抑制脂质生成，在肝脏脂质代谢异常的疾病中发挥着治疗作用[11]。

甘草酸对AMPK/ACC/SREBP信号通路的影响见图1。由图1可知：与正常组(LC)相比，高脂饮食组(HF)小鼠AMPK和ACC的磷酸化水平以及SREBP的表达都出现了显著降低(P<0.05)，提示长期高脂饮食能够抑制AMPK/ACC/SREBP信号通路的活性。给予相应药物干预之后，甘草酸低剂量(HF+GA-50 mg/kg)、甘草酸高剂量(HF+GA-100 mg/kg)和二甲双胍(HF+Met-250 mg/kg)均可以显著提高AMPK和ACC 的磷酸化水平，SREBP的表达也明显增加，与模型组(HF)相比，具有显著性差异(P<0.05)。