miR-93表达与内镜黏膜下剥离术治疗老年早期胃癌预后的关系及其靶向抑癌基因的生物信息学分析*

杨洁，彭志红，吴宏博

[陆军军医大学第一附属医院（重庆西南医院）消化内科，重庆400038]

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，随着胃镜检查的普及，早期胃癌的检出率有所提高，在胃癌局限于黏膜或黏膜下层的早期阶段进行治疗，能够明显改善预后，5年生存率可超过90.0%。内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection，ESD）是近年发展起来的治疗手段，可以一次性大块、完整的切除直径2 cm 以上的黏膜病变，用于早期胃癌的治疗能取得组织学治愈性切除，远期疗效理想[1]。也有研究[2]报道，ESD 治疗早期胃癌后仍有3.2%的患者存在术后复发的可能；国内刘黎等[3]的临床研究显示，胃癌浸润深度是早期胃癌术后复发的独立危险因素。因此，对可能复发的高危人群进行早期预警，并给予相应的辅助治疗或靶向治疗，对改善预后、降低复发率具有积极价值。

微小RNA（micro RNAs，miRs）是在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA，具有广泛的生物学效应，与多种恶性肿瘤的发生有着密切关系。相关临床研究[4]证实，miR-21、miR-25、miR-93 和miR-106b 在胃癌组织中表达增多，其中miR-93 是具有促癌作用的miR；有细胞研究[5-6]证实，miR-93 能够靶向胃癌细胞中的抑癌基因PTEN和TIMP2，并发挥促癌作用，与其在早期胃癌中高表达的趋势相吻合。但早期胃癌中高表达的miR-93 是否对术后复发具有预测价值仍未明确。本研究选取接受ESD 的老年早期胃癌患者作为研究对象，分析miR-93 表达与预后的关系，并利用生物信息学初步探究miR-93 的靶向抑癌基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年1月－2017年12月本院确诊为早期胃癌的老年患者268例。其中，男139例，女129例，年龄61～70 岁，平均（62.82±12.95）岁。另取同期在本院接受胃镜下胃黏膜活检、经病理证实为正常胃黏膜、且一般资料匹配的受试者95例作为对照组。其中，男55例，女40例，年龄60～67岁，平均（63.34±12.19）岁。早期胃癌患者和正常胃黏膜受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①接受ESD治疗；②术后病理学检查诊断为胃癌；③TNM 分期为T1-2N0期；④年龄≥60 岁；临床病理资料完整；⑤随访资料完整。排除标准：①术前接受过放化疗；②术后接受放化疗；③既往有其他恶性肿瘤病史；④随访过程中发生失访。

1.2 试剂及仪器

miRNA 提取分离试剂盒、miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、miRNA 荧光定量检测试盒购自天根生化科技（北京）有限公司，RIPA 裂解液购自上海碧云天公司，兔单克隆PTEN 和TIMP2 一抗购自Abcam 公司。荧光定量PCR 仪为Bio-Rad 公司，凝胶成像仪为上海勤翔科学仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 荧光定量PCR 检测miR-93 的表达取早期胃癌组织和正常胃黏膜组织，使用miRNA 提取分离试剂盒提取组织样本中的miRNA。使用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒配置反转录体系，将miR 反转录为cDNA；miRNA 荧光定量检测试剂盒配置荧光定量PCR 体系：cDNA 2 μL、混合液10.0 μL、10 μmol/L 上游引物0.6 μL、10 μmol/L 通用下游引物0.6 μL、去离子水6.8 μL，在PCR 仪上按照95℃预变性，3 min 后按95℃5 s、60℃15 s 的程序反应40 个循环，根据循环曲线计算miR-93 的表达量。

1.3.2 Western blot 检测PTEN 和TIMP2的表达取早期胃癌组织和正常胃黏膜组织，加入RIPA 裂解液后充分研磨、提取蛋白，测定蛋白含量后，取30 μg 蛋白样本进行Western blot 检测，将蛋白样本加入SDS-PAGE，电泳后电转移至NC 膜，5%脱脂牛奶在室温下封闭NC 膜1 h，1∶1 000 稀释的PTEN 和TIMP2 单克隆抗体4℃孵育NC 膜过夜；第2天以1∶1 000 稀释的HRP 二抗孵育NC 膜1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算PTEN 和TIMP2 的表达量。

1.4 术后随访

所有早期胃癌患者在术后3 个月内每个月复查1 次，术后3～12 个月则每3 个月复查1 次，1年后每6 个月复查1 次，复查项目包括血常规、生化和胃镜等。随访截止日期2019年10月31日，记录患者的复发情况。

1.5 生物信息学分析

在Targetscan 网站上进行miR-93 靶向PTEN、TIMP2 的生物信息学分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件录入数据，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；两计量资料间的相关性分析采用Pearson 检验；复发影响因素采用COX 回归模型分析；复发率的比较采用Kaplan-Meier 曲线；miR-93 预测复发的价值采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-93、PTEN和TIMP2 表达量比较

与正常胃黏膜组织比较，早期胃癌组织中miR-93 的表达量明显增加，PTEN 和TIMP2 的表达量明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1 和表1。经Pearson 检验，早期胃癌组织中miR-93 的表达量与PTEN 和TIMP2 的表达量呈负相关，相关系数分别为-0.412 和-0.384（P＜0.05）。

图1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中PTEN和TIMP2的蛋白条带Fig.1 Protein bands of PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue

表1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

表1 早期胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 1 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer and normal gastric mucosa tissue（±s）

类别早期胃癌组织（n=268）正常胃黏膜组织（n=95）t值P值miR-93 0.60±0.24 0.41±0.09 7.53 0.000 PTEN 0.52±0.11 0.93±0.18 26.04 0.000 TIMP2 0.45±0.10 1.32±0.32 39.48 0.000

2.2 不同临床病理特征早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2 表达量比较

不同性别、年龄患者的早期胃癌组织中miR-93、PTEN 和TIMP2 表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌组织中miR-93 的表达量高于T1期、中分化和高分化、黏膜内早期胃癌组织，PTEN 和TIMP2 的表达量明显低于T1期、中分化和高分化、黏膜内早期胃癌组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

表2 不同临床病理特征早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 2 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissue with different clinicopathological features（±s）

类别性别男（n=139）女（n=129）t值P值年龄≤65岁（n=101）＞65岁（n=167）t值P值T分期T1期（n=98）T2期（n=170）t值P值分化程度中分化和高分化（n=102）低分化和未分化（n=166）t值P值浸润深度黏膜内（n=182）黏膜下（n=86）t值P值miR-93 0.57±0.22 0.63±0.28 1.96 0.051 0.58±0.21 0.61±0.30 0.88 0.378 0.46±0.17 0.68±0.29 6.86 0.000 0.44±0.19 0.70±0.28 8.28 0.000 0.54±0.16 0.71±0.30 6.05 0.000 PTEN 0.51±0.09 0.53±0.12 1.40 0.162 0.50±0.08 0.52±0.13 1.39 0.164 0.64±0.13 0.45±0.06 16.30 0.000 0.61±0.12 0.46±0.08 12.27 0.000 0.57±0.14 0.42±0.07 9.39 0.000 TIMP2 0.46±0.08 0.44±0.13 1.53 0.128 0.46±0.09 0.44±0.12 1.45 0.149 0.66±0.13 0.33±0.08 26.73 0.000 0.60±0.12 0.36±0.07 20.67 0.000 0.54±0.11 0.26±0.08 21.11 0.000

2.3 复发与未复发患者早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2 表达量比较

与未复发患者比较，复发患者早期胃癌组织中miR-93 的表达量明显增加，PTEN 和TIMP2 表达量明显减少，两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 早期胃癌患者术后复发影响因素COX 回归分析

以是否复发为应变量，性别、年龄、T 分期、分化程度、浸润深度、miR-93、PTEN 和TIMP2 为自变量，进行COX 回归分析，结果显示：黏膜下浸润、miR-93 表达增多、PTEN 及TIMP2 表达减少是早期胃癌患者术后复发的危险因素。见表4。

2.5 miR-93 预测早期胃癌患者术后复发的Kaplan-Meier 曲线及ROC 曲线分析

根据早期胃癌组织中miR-93 表达量的中位数分为miR-93低表达和高表达，绘制未复发的Kaplan-Meier曲线，与miR-93 低表达患者比较，miR-93 高表达患者的未复发率较低（P＜0.05）；绘制miR-93 表达量预测早期胃癌患者复发的ROC 曲线，曲线下面积为0.7015（95%CI：0.583～0.820），根据约登指数最大值确定最佳截点为0.72，灵敏度和特异度分别为66.02%和66.67%。见图2 和3。

2.6 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息学分析

miR-93 靶 向PTEN 基 因 为mRNA 3’UTR 序 列的第272-278 碱基，靶向TIMP2 基因为mRNA 3’UTR 序列的第1 961-1 967 碱基。见图4。

表3 复发与未复发患者早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

表3 复发与未复发患者早期胃癌组织中miR-93、PTEN和TIMP2表达量比较（±s）Table 3 Comparison of expression of miR-93,PTEN and TIMP2 in early gastric cancer tissues of patients with and without recurrence（±s）

类别未复发（n=256）复发（n=12）t值P值miR-93 0.59±0.24 0.76±0.19 2.99 0.003 PTEN 0.73±0.18 0.51±0.07 9.59 0.000 TIMP2 0.88±0.17 0.43±0.06 22.35 0.000

表4 早期胃癌患者术后复发影响因素COX回归分析Table 4 Cox regression analysis of influencing factors of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

图2 早期胃癌患者术后复发的Kaplan-Meier曲线Fig.2 Kaplan-Meier curve of postoperative recurrence in patients with early gastric cancer

图3 miR-93预测早期胃癌患者术后复发的ROC曲线Fig.3 ROC curve of miR-93 in predicting postoperative recurrence of patients with early gastric cancer

图4 miR-93靶向PTEN和TIMP2的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-93 targeting PTEN and TIMP2

3 讨论

ESD 在早期胃癌的治疗中表现出积极价值，具有创伤小、组织学切除彻底等优势，但仍有部分患者发生术后复发，造成预后不良。因此，筛选可能发生术后复发的高危早期胃癌患者，并尽早在术后进行辅助治疗和靶向治疗，具有积极的临床意义。miR-93 是一种具有促癌作用的miRNA，在包括胃癌在内的多种消化道恶性肿瘤中均呈高表达趋势[7-10]，也有研究[11]表明，早期胃癌血清中miR-93的表达增多。本研究对入组的早期胃癌患者进行了miR-93 表达量的分析，发现早期胃癌组织中miR-93 的表达量明显高于正常胃黏膜组织，与既往研究结果[9，11]一致，验证了miR-93 高表达与早期胃癌发生的关系。

miR-93 的促癌作用包括促进癌细胞增殖、迁移和侵袭，胃癌细胞中的PTEN 和TIMP2 已经被证实受到miR-93 调控[5-6]。PTEN 和TIMP2 均是重要的抑癌基因，前者通过抑制PI3K/AKT 通路来抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡[12-13]，后者通过抑制基质金属蛋白酶的活性来抑制细胞迁移、侵袭[14]。当miR-93表达增多时，能够抑制PTEN 及TIMP2 的表达，并使细胞凋亡受阻，导致细胞增殖、迁移及侵袭增强。在早期胃癌的病理进程中，癌细胞的增殖、迁移、侵袭与肿瘤病灶的生长、分化、浸润均密切相关。本研究分析不同病理特征的早期胃癌组织中miR-93 表达的差异，发现T2期、低分化和未分化、黏膜下早期胃癌组织中miR-93 的表达量明显升高，受miR-93 调控的PTEN 和TIMP2 表达量减少，且miR-93 与PTEN、TIMP2 呈负相关，说明miR-93高表达不仅参与了早期胃癌的发生，还加速了早期胃癌病灶生长、分化程度降低、黏膜下浸润等病理特征的恶化。进一步在Targetscan 网站进行生物信息学分析可知，PTEN 及TIMP2 基因mRNA 的3’UTR 上含有miR-93 的结合位点，符合miR-93 靶向抑制PTEN 及TIMP2 表达的生物学效应。因此，靶向抑癌基因PTEN、TIMP2 并介导促进增殖、侵袭等生物学效应，可能是miR-93 高表达参与早期胃癌发生发展的分子机制。

已有研究[15-16]报道，肿瘤病理特征是早期胃癌患者术后复发的影响因素；刘黎等[3]临床研究显示，胃癌浸润深度及原癌基因β-catenin、抑癌基因E-cadherin 表达异常是早期胃癌术后复发的独立危险因素。本研究对早期胃癌患者ESD 后复发情况进行随访及分析，复发的早期胃癌患者中miR-93 表达增加，而抑癌基因PTEN、TIMP2 表达减少，提示：miR-93 及受其调控的PTEN、TIMP2 表达异常，可能与早期胃癌术后复发有关。进一步通过COX 回归模型验证，黏膜下浸润、miR-93 表达增多、PTEN 及TIMP2 表达减少均是早期胃癌术后复发的危险因素；黏膜下浸润作为危险因素、与刘黎等[3]报道一致；miR-93 高表达、PTEN 及TIMP2 表达减少作为危险因素，与相应的生物学功能吻合。

miR-93 的促癌作用被广泛证实，可能在癌细胞恶性生物学行为中处于上游调控地位，通过调控下游包括PTEN、TIMP2 在内的多种靶基因来增强癌细胞恶性生物学行为。因此，miR-93 表达的改变，可以通过复杂的下游机制来造成早期胃癌的发生发展，同时也影响远期预后，造成局部复发。在COX回归模型验证了miR-93 表达增加与早期胃癌术后复发的关系后，本研究还通过Kaplan-Meier 曲线及ROC 曲线分析了miR-93 预测复发的价值，结果显示，miR-93 高表达的早期胃癌患者术后复发率更高，且miR-93 的表达对早期胃癌术后复发具有预测价值。因此，miR-93 的表达可能成为预测早期胃癌术后复发、筛查早期胃癌术后复发高危人群的标志物，也可能成为治疗早期胃癌、预防复发的治疗靶点。

综上所述，早期胃癌中miR-93 表达增多与病理特征恶化、抑癌基因PTEN 及TIMP2 表达减少以及ESD 术后复发有关；miR-93 高表达是早期胃癌患者ESD 术后复发的危险因素，对术后复发具有预测价值，靶向抑癌基因PTEN 和TIMP2 是其可能的生物学作用。本研究的不足之处是随访时间较短，今后将进一步延长随访时间，并深入挖掘miR-93在早期胃癌发生发展中的作用及可能机制。