152份黄淮海麦区小麦农家品种抗条锈性评价及重要条锈病抗性基因的分子检测

管方念，龙黎，姚方杰，王昱琦，江千涛，康厚扬，蒋云峰，李伟，邓梅，李豪，陈国跃

（1四川农业大学小麦研究所，成都 611130；2西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室，成都 611130；3四川农业大学农学院，成都 611130）

0 引言

【研究意义】由条型柄锈菌（Puccinia striiformisWest. f. sp.tritici，Pst）引起的小麦条锈病是世界范围内最重要的小麦病害之一，严重影响了小麦的产量和品质，在非洲、亚洲、大洋洲、欧洲、北美洲和南美洲等60多个国家分布流行和危害小麦生产[1-4]。中国的小麦产区是世界上最大且相对独立的小麦条锈病流行区，且病害发生流行规律比其他国家更加复杂，该病害对中国西南、西北等地方的冬、春麦区危害最为严重[3,5-9]。2008年，中国植物病理学家分别在四川省和甘肃省等地分离得到同时对Yr24/Yr26和Yr10有毒性的新型毒力类型，该毒力类型对贵农22毒性稳定，简称G22-9致病类型。此后连续多年相继在云南省、陕西省、青海省、山西省、新疆维吾尔自治区、贵州省和西藏自治区等地方发现，并且频率呈现逐年上升态势，对中国的小麦生产构成了极大威胁[10-12]。2016年1月，经全国小麦锈病和白粉病研究协作组会商决定，将 G22-9致病类型正式命名为条中34号生理小种（CYR34）[13]。CYR34的出现及流行频率的逐年增高，标志着中国小麦条锈菌群体结构继Hybrid 46和水源11类群后又一次发生重大变异，使得中国小麦再次受到条锈病大流行的威胁。针对当前小麦生产上流行条锈病菌生理小种或毒力类型，鉴定一批新的抗性种质，发掘和聚合条锈病抗性新基因并转育到当地品种（系），培育一系列抗病品种被认为是预防条锈病危害、确保小麦高产稳产最为经济环保和有效的手段[5-6]。【前人研究进展】地方品种，又称农家品种、本地品种，是经过长期的人类干预和自然选择后保存下来的作物遗传资源，具备了对当地自然生态环境的较强适应性和与之相应的生产潜力，还可能潜藏着育成品种所缺乏的具有重要经济价值的优良基因[14-15]。与世界上大多数国家的品种相比，中国小麦农家品种具有早熟性、多粒性、高度适应性、高亲和性、抗病虫及抗逆等特点，因此受到小麦遗传育种学家的高度重视。尤其在小麦条锈病抗性方面，从资源鉴定、抗性基因发掘到育种利用，对中国小麦农家品种展开了较为系统的研究。早在20世纪80年代，路端谊等[16]利用当时中国流行的条锈病优势生理小种条中1号、条中10号、条中17号、条中18号、条中19号和条中21号对757份中国小麦农家品种进行成株期抗病性鉴定，揭示了长江流域比黄河流域的农家品种抗性更好，且南方农家品种具有更强的抗锈性。近年来，随着条锈菌新小种或新毒力类型的产生和发展速度加快，严重威胁着中国小麦生产安全[17]。鉴于此，近年来，中国小麦病理和遗传学家利用表型鉴定并结合分子标记技术加快了对中国小麦农家品种较为系统的条锈病抗性评价与鉴定。孙建鲁等[18]通过利用条锈菌单小种及混合小种对 100份小麦品种资源（包括 13份农家品种、27份引进种质和60份育成种质）进行苗期和成株期条锈病抗性鉴定，结果发现农家品种在苗期（61.54%）和成株期（76.92%）均表现出较大比例的抗性；已知Yr特异分子标记检测表明农家品种中含未知Yr频率较高，应加强利用。黄苗苗等[19]对 223份小麦农家品种进行了成株期条锈病抗性表型鉴定与评价，并利用6个已知Yr基因分子标记进行了检测，共有50份农家种表现为成株期抗性，99份具有慢条锈病特性，这些农家种中可能携带Yr26、Yr9、Yr5、Yr10、Yr15和Yr18。王吐虹等[20]在 40份小麦农家品种中发现有 35份含有未知的抗条锈病基因，占87.5%，而且有较高的遗传异质性。说明小麦农家品种中含有丰富的抗病基因。【本研究切入点】黄淮海麦区作为中国条锈病菌的重要春季流行区，小麦条锈病也是该麦区最重要的病害，每年都有不同程度的发生[21]。新毒性生理小种CYR34的产生已引起黄淮海麦区大部分主栽抗性品种丧失抗性，为小麦条锈病防治工作带来严峻挑战。因此，明确该麦区小麦地方品种的抗性表现和可能携带的抗性基因，鉴定一批可直接用于小麦条锈病抗性育种的优异种质并将其抗性基因/位点/区段转育到小麦新品种（系）至关重要。【拟解决的关键问题】本研究利用当前中国小麦生产上毒性强、流行频率高的条锈菌生理小种和毒力类型对 152份来源于黄淮海麦区小麦农家品种进行抗性鉴定，并利用13个条锈病已知抗性基因紧密连锁标记（或功能标记）进行分子检测，为条锈病抗性育种提供材料基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦农家品种：152份黄淮海麦区小麦农家品种，包括52份山东农家品种、45份河南农家品种、26份河北农家品种、15份陕西农家品种和14份江苏农家品种，均由中国国家作物种质资源库提供。已知条锈病抗性基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr39、Yr48、Yr65和Yr67载体由美国华盛顿州立大学陈贤明教授提供。室内苗期条锈病鉴定对照铭贤 169由甘肃农业科学院植物保护研究所贾秋珍研究员提供。成株期条锈病鉴定诱发材料SY95-71及感病对照Avocet S由四川农业大学小麦研究所提供。

供试条锈病菌：采用 2个生理小种 CYR32和CYR34进行室内苗期条锈病抗性鉴定，单小种鉴定；采用由CYR32、CYR33、CYR34、水源4号和水源5号组成的混合菌种进行田间成株期条锈病鉴定。上述菌种均由甘肃农业科学院植物保护研究所贾秋珍研究员提供。

1.2 小麦条锈病抗性表型鉴定

1.2.1 室内苗期接种鉴定 苗期鉴定在甘肃农业科学院植物保护研究所温室中完成。每份种质播种10—15粒，温室培养至一叶一心期，采用涂抹法[22]分别接种条锈病菌CYR32和CYR34生理小种，放置于接种室黑暗低温（10℃）保湿24 h后移至人工温室（14—18℃，光照16 h/黑暗8 h）中培养，待对照品种铭贤169充分发病后按0—4级标准记载侵染型[23]，即0—2级为抗病，3—4级为感病。

1.2.2 田间人工诱发鉴定 2016—2017年和2018—2019年于小麦生产季分别在四川农业大学崇州试验基地（30°33′N，103°39′E。2016CZ，2018CZ）和绵阳市农业科学院试验站设置条锈病鉴定圃（31°23′N，104°49′E。2016MY）进行成株期条锈病抗性鉴定。采用人工接种法[24]，3个环境均采用同样的田间播种设计：每份种植3行区、行长2.0 m，行距0.3 m，株距0.2 m，单粒点播，每间隔 20行设置一行感病对照Avocet S。为确保田间菌量充分，鉴定圃四周播种 2行区诱发材料SY95-71。每年1月中旬小麦分蘖中后期，通过涂抹法在诱发行小麦叶片接种混合小种，待3月下旬至4月中旬感病对照Avocet S充分发病后，调查病害的普遍率、严重度和侵染型[25]，每隔7 d调查1次，共调查3次。

1.2.3 分子标记检测 采用改良的 CTAB法[26]提取152份黄淮海麦区小麦农家品种和Yr基因载体DNA。利用国内外现已开发的条锈病抗性基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81等13个标记[27-39]对黄淮海麦区小麦农家品种进行PCR扩增，扩增产物经2.0%的琼脂糖电泳或6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后照相保存，并对Yr80和Yr81抗性基因的KASP标记进行荧光定量PCR扩增检测。供检测Yr基因分子标记的引物均由擎科生物技术有限公司合成（电子附表1）。

2 结果

2.1 黄淮海麦区小麦农家品种苗期抗条锈病的鉴定

分别采用当前小麦生产上条锈病流行生理小种CYR32和CYR34对供试152份黄淮海麦区小麦农家品种进行苗期抗性鉴定。在供试种质中，9份农家品种对CYR32具有苗期抗性，约占6%，其中，2份表现为免疫或近免疫。9份农家品种对CYR34表现苗期抗性，其中1份表现为免疫或近免疫（电子附表2）。对比分析发现，仅半截芒大白麦和白穗白2份种质对CYR32和CYR34同时表现苗期抗性。结果表明，黄淮海麦区小麦农家品种对中国当前小麦条锈病流行小种整体抗性水平较低。

2.2 黄淮海麦区小麦农家品种成株期抗条锈病鉴定

利用由CYR32、CYR33、CYR34、水源4号和水源5号组成的条锈菌混合生理小种进行人工诱发，在多环境下（2016CZ、2016MY和 2018CZ）对黄淮海麦区小麦农家品种进行成株期条锈病抗性鉴定。在2016MY鉴定圃中，62份种质在成株期具有抗性，占40.78%。在2016CZ鉴定圃中，57份在成株期表现抗性，占37.50%。在2018CZ鉴定圃中，60份种质具有成株期抗性，占39.47%。对比3个环境抗性鉴定结果，35份种质在3个环境均表现为稳定的成株期抗性，占23.03%。其中，13份种质在成株期表现低侵染型、低严重度反应的高抗病性（IT=0—1、FDS＜20%）（电子附表2）。

2.3 黄淮海麦区抗条锈病小麦农家品种区域分布及综合评价

结合苗期和成株期抗性结果，共鉴定出7份具有全生育期抗性（all stage resistance，ASR）农家品种。152份黄淮海麦区农家品种中，来自山东省的52份种质中，10份表现出成株期抗性（adult-plant resistance，APR），占19.23%，其中1份表现出全生育期抗性；来自河北省的26份种质中，仅红秃头表现出成株期抗性；来自陕西省的15份种质中，8份在成株期表现出抗性，占53.33%；来自江苏省的14份种质中，4份表现出成株期抗性，占35.70%，其中1份表现出全生育期抗性；来自河南省的48份种质中，12份表现出成株期抗性，占35.41%，其中5份表现出全生育期抗性。

2.4 黄淮海麦区小麦农家品种条锈病抗性基因分子检测

利用国内外学者开发的已知抗条锈病基因Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81紧密连锁的侧翼标记或功能标记对 152份黄淮海麦区小麦农家品种进行分子检测，分别以13个条锈病抗性基因载体作为阳性对照，得出在供试的黄淮海麦区小麦农家品种中，131份种质可能携带Yr18，2份可能携带Yr41，13份可能携带Yr48，57份种质可能携带Yr81；其中，2份种质可能同时携带Yr18和Yr41，8份可能同时携带Yr18和Yr48，49份材料同时携带Yr18和Yr81（图1和图2），7份同时携带Yr48和Yr81。供试材料中并未检测到可能携带Yr9、Yr10、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr65、Yr67和Yr80的种质；另外11份种质未检测到上述检测Yr基因。在9份表现苗期抗性和42份成株期稳定抗性种质中，5份均未检测到所有供试的13个Yr基因标记的存在，推测这些抗性种质可能携带了其他已知或未知小麦条锈病抗性基因（组合）。

3 讨论

3.1 新毒性生理小种的产生对黄淮海麦区小麦条锈病防治的挑战

图1 黄淮海麦区部分材料Yr18连锁标记csLV34检测Fig. 1 Detection results of agarose gel by using the marker csLV34 linked to the stripe rust resistance gene Yr18 in part of wheat landraces from Huang-huai-hai

图2 黄淮海麦区部分材料Yr81连锁标记KASP_3077荧光定量PCR检测Fig. 2 Detection results of Real-Time PCR by using the marker KASP_3077 linked to the stripe rust resistance gene Yr81 in part of wheat landraces from Huang-huai-hai

近年来，在条锈病常发易变区的四川省和甘肃省麦区，随着条锈病新毒性菌系——贵农22致病类群，特别是贵农22致病类型9，简称G22-9致病类型（即CYR34）的出现及扩展，标志着中国小麦条锈菌群体结构又一次重大变化发生[13]。目前，以G22-9致病类型（CYR34）为代表的贵农 22致病类群在哺育寄主选择压力下已发展成为中国小麦生产上流行频率最高的条锈病菌优质类群，导致目前中国抗病育种中广泛用作抗源的Yr10、Yr24/26和川麦42、南农92R系、贵农系和兰天系品种丧失抗性，这预示着强毒性新小种CYR34在全国范围流行的风险越来越高[40-41]。黄淮海麦区是中国小麦主产基地，也是中国条锈病重要的春季流行区，是保障中国粮食安全的小麦条锈病流行主要防控地区[10]。因此，了解该麦区农家品种的条锈病抗性遗传背景及抗性基因分布，加快发掘抗病新基因及培育抗病新品种，是拓宽小麦抗性遗传基础及抗性育种的关键。

3.2 黄淮海麦区小麦地方品种携带Yr18和Yr81的状况

利用紧密连锁分子标记进行分子检测并与抗谱分析、系谱分析在内的其他方法相结合是准确鉴定目标基因的重要手段[42]。Yr18是成株期抗性基因，来源于普通小麦，定位于7DS，其载体品种有Thatcher、Jupeteco 73R和Anza等，是公认的慢锈性基因，可能提供持久抗性，目前还没有检测到其有生理专化性[43]。前人研究证实，中国小麦农家品种中携带抗病基因Yr18占比较高。杨文雄等[44]对231份小麦种质进行条锈病抗性基因鉴定，发现仅有 6.1%育成品种携带Yr18，而85.1%的农家品种携带Yr18。白小军等[45]对来自宁夏的小麦农家品种的条锈病抗性基因分布进行检测发现，农家品种中携带Yr18的比例（90.9%）远远大于育成品种（7.7%）和引进品种（14.3%）。本研究利用Yr18的功能标记对黄淮海麦区小麦农家品种进行检测也发现，131份种质（86.18%）携带该成株期条锈病抗性基因，进一步证实了Yr18在中国黄淮海麦区小麦农家品种中广泛存在。已有研究表明在高病害压力下Yr18单独存在时其抗性表现不明显，但结合 2—4个其他慢锈基因则可获得高抗或近免疫抗性[46-47]。本研究42份携带Yr18的小麦农家品种在成株期表现出高抗条锈病，推测这些种质可能还携带对当前小麦生产中流行小种具有抗性的其他已知或未知基因及其组合。最近，澳大利亚学者通过对1份来自中国的小麦农家品种（Aus27430）条锈病抗性表型分析，发现该种质对澳大利亚条锈病流行生理小种在苗期表现为抗性，而在成株期则表现为中抗-中感反应。通过构建重组自交系遗传作图群体并结合小麦 90K SNP芯片和基于常规PCR分子标记技术，将该抗性基因定位在6A短臂上，并正式命名为Yr81[39]。本研究利用Yr81的特异KASP分子标记KASP_3077对152份黄淮海麦区农家品种进行分子检测，发现其中有57份小麦农家品种可能携带该基因，证实Yr81普遍存在于中国小麦农家品种中。迄今为止，尚未有学者利用中国条锈病生理小种对Yr81进行毒性研究。本研究利用CYR32和CYR34对携带Yr81的小麦农家品种进行抗性表型分析发现，供试材料中携带了Yr81的农家种在苗期多表现为感病反应（IT=3—4）；利用混合小种进行成株期条锈病抗性表型鉴定发现，也多表现为感病。进一步分析发现，同时含有Yr18和Yr81的49份农家种中，9份成株期表现出良好抗性（DS=0—10%），2份材料表现出全生育期抗性（电子附表2），推测Yr18和Yr81的聚合可以显著提高条锈病抗性，这与前人研究结果一致[46-47]。因此，可将Yr81与包括Yr18在内的其他条锈病抗性基因进行聚合在条锈病抗性育种中加以利用。另外，本研究利用条锈病混合菌种对供试材料在多环境下进行成株期抗性鉴定，发现携带了相同抗性基因或基因组合，在不同鉴定环境下其抗感表型或抗性程度不尽相同，可能与环境条件、鉴定的时期等有关。因此，为进一步精准鉴定供试农家种对当前我国小麦生产上条锈病主要流行小种或致病类群的抗性反应，利用单一小种或致病类群在可控环境（室内）对供试农家种进行成株期条锈病抗性鉴定将是我们下一步的工作重点。

3.3 黄淮海麦区小麦地方品种携带未知基因的抗性材料

3个小麦成株期条锈病抗性基因Yr30、Yr36和Yr39，分别来源于墨西哥品系 RL6077[31]、野生二粒小麦 RSL65[32]和美国春小麦品种 Alpowa[33]。通过遗传作图和分子标记，分别将它们定位小麦染色体3BS、6BS和7BL上。本研究利用其紧密连锁标记对黄淮海麦区农家品种进行分子检测发现，该麦区的所有供试小麦农家品种均未检测到这个 3个抗病基因的存在。近年来，随着新的强毒性条锈病生理小种的出现并流行，从农家品种中发掘新的有效抗性基因并培育条锈病抗性新品种已成为共识，从小麦农家品种中发掘新的条锈病抗性基因已成为关注的热点。系谱分析发现，最近报道的4个正式命名的小麦条锈病新基因Yr79、Yr80、Yr81和Yr82均来自不同国家的农家品种[38-39,48-49]，证实小麦农家品种中携带丰富的可用条锈病抗性基因，是小麦条锈病抗性育种的有效基因源。黄淮海麦区是中国小麦主产基地，也是中国条锈病重要的春季流行区，是保障中国粮食安全的小麦条锈病流行主要防控地区。因此，了解该麦区的条锈病抗性遗传背景及抗性基因分布，已成为防控条锈病危害的基础性工作。本研究利用小麦生产上流行的强毒性生理小种CYR32和CYR34对152份来自黄淮海麦区小麦农家品种进行条锈病抗性鉴定，并结合Yr基因进行分子检测发现，42份具有成株期稳定抗性的小麦农家品种中，4份种质（爪子牙、蚰子头、石岛三棵和白蚰子）未检测到其携带所有供试已知抗性基因；9份具有苗期抗性的小麦农家品种中，1份种质（白芒白）未检测到其携带所有供试已知抗性基因，说明这些小麦农家品种可能携带对当前小麦生产中流行小种具有抗性的其他已知或未知基因及其组合，是在小麦条锈病持久抗性育种中可进一步利用的新抗源。

4 结论

黄淮海麦区小麦农家品种对当前中国流行的条锈病毒性小种或毒力类群主要表现为成株期抗性，其抗性受多个微效成株期抗性基因控制；该麦区小麦农家品种主要携带Yr18和Yr81；在9份表现苗期抗性和42份成株期稳定抗性种质中，共有5份种质未检测到其携带所有供试已知抗性基因，推测这些抗性种质可能携带了对当前小麦生产中流行小种具有抗性的其他已知或未知小麦条锈病抗性基因（组合），是进一步发掘抗条锈病基因并转育到当前小麦新品种（系）中的重要基因源。