外泌体环状RNAs：人类癌症的新型生物标志物*

商安全 综述，孙俊俊，谷晨峥，平伊丽，孙祖俊，李 冬△ 审校

(1.同济大学附属同济医院检验科，上海200065；2.同济大学医学院，上海 200065；3.江苏省盐城市第六人民医院检验医学科，江苏盐城 224005)

外泌体(Exo)是一种纳米大小的膜性囊泡，含有活性物质(DNA、RNA、蛋白质、脂质等)，通过调节细胞间的多种生物过程，在生物学功能及正常机体反应中为细胞间传递效应信息提供了一种新的方法。环状RNA(circRNAs)是一类具有封闭环状结构的非编码RNA(ncRNA)。circRNAs作为微小RNA(miRNA)海绵、RNA结合蛋白海绵和翻译调节因子在基因表达调控中发挥着重要作用。circRNAs与疾病的发展密切相关，已成为研究热点。

1 Exo

1.1Exo的起源与特征 Exo是由大多数细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和肥大细胞)产生和释放的一类直径为30～200 nm的细胞外囊泡(EVs)。Exo直接从质膜出芽，在其表面有多种生物分子，包括DNA、RNA、蛋白质、脂类等[1]。在Exo内部同样存在DNA、信使RNA(mRNA)、miRNA和不同的蛋白质。Exo来源于内泌体途径[2]。在内体成熟的早期到晚期，内体特殊地向内出芽形成多泡体(MVBs)。MVBs可与溶酶体融合，致使内腔小泡(ILVs)发生降解。当MVBs与细胞膜融合时，ILVs中又发生了一次向内芽接，产生纳米级的囊泡，并将这些分子分泌到细胞外空间，称为Exo。运输所需的内体分选复合体(ESCRT)机制在促进内体的形成中起着至关重要的作用[3]。其中，ESCRT0在晚期核内体膜中识别并获得泛素化蛋白，ESCRT1和ESCRT2都触发了MVBs的萌发和蛋白质Exo的分类，ESCRT3则形成螺旋状结构，有助于MVBs萌芽颈的闭合和腺苷三磷酸酶(ATPase)细胞液泡分选蛋白4(Vps 4)驱动膜的切断。在这个过程的最后，Vps 4介导所有ESCRT分子的回收，而泛素化蛋白对ESCRT的定位和功能起修饰或调节作用[4]。Exo的分泌则由不同的分子调节，如Rab27[5]、Rab35和Ral蛋白[6]。

1.2Exo的功能

1.2.1调节免疫系统 Exo具有不同的功能，包括抗原呈递、免疫激活和免疫逃逸。抗原呈递分为抗原递呈细胞(APC)直接传递和间接传递。由于Exo的大小和结合位点的限制，与间接传递相比，Exo的直接传递较弱。在脑胶质瘤小鼠模型中，来自树突状细胞的Exo可诱导强大而有效的抗肿瘤T细胞免疫反应。富含伴侣蛋白的细胞裂解物(CRCLs)可能在抗肿瘤疫苗中很重要。在该研究中，抗肿瘤的作用机制是通过调节Cbl-b和c-Cbl信号来实现的[7]。Exo激活免疫系统的同时，也导致免疫逃逸。肿瘤细胞释放的EVs抗原可阻止T细胞或树突状细胞活化[8]。

1.2.2促进癌症转移 癌症转移的机制非常复杂，Exo可能对此有所帮助。癌症细胞分泌的Exo能促进上皮细胞-间充质转化(EMT)[9]，这是癌细胞从上皮至间质表型的重编程。EMT为癌细胞转移提供了“友好”的环境。Exo也决定了有机性转移[10]。肿瘤特异性Exo被器官特异性细胞摄取，并制备了转移前的基质。DHONDT等[11]发现，Exo中的某些miRNAs也会促进癌细胞转移。例如，含miR-200的Exo可促进乳腺癌细胞转移[12]。Exo中miR-105破坏了血管内皮屏障，从而促进癌症转移[13]。乳腺癌分泌的Exo携带miR-122编程葡萄糖代谢，进而促进乳腺癌细胞转移[8,14]。

1.2.3生物标志物 近年来，Exo被认为是细胞间通讯的重要介质，其在疾病诊断和创新治疗中的临床应用也不断被挖掘[15]。目前，临床上普遍认为Exo具有作为生物标志物和治疗靶点的巨大潜力。CAMUSSI等[16]发现了Exo介导的细胞间通讯的4种机制。首先，Exo通过直接刺激靶细胞作为信号复合物发挥作用，这是不可缺少的，特别是在血小板凝固过程中，中性粒细胞可释放表达活化的白细胞整合素αMβ2(或Mac-1)的Exo，从而促进血小板活化。第二，Exo能够在细胞间转移受体。受体转移过程可以发生在各种类型的细胞上，如B细胞[17]、血小板、内皮细胞和肿瘤细胞。其次，Exo可以在靶细胞内释放，并释放其携带的蛋白质。研究表明，NPC细胞可以释放含有半乳糖凝集素9蛋白(GAL9)和(或)LMP1的人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类阳性的Exo，后者具有固有T细胞抑制活性[18]。最后，Exo主要通过依赖Exo携带的miRNAs、mRNAs或DNAs的转化来传递遗传信息，从而影响靶细胞中的表达。XUE等[19]发现，血清中的exo-miR-93与临床特征(包括分期和肿瘤大小)之间存在明显相关性。除了通过转运遗传物质进行细胞间通信的信使外，Exo还直接与细胞外基质(ECM)相互作用。活化的中性粒细胞来源的Exo分别通过整合素Mac-1和表面结合的中性粒细胞弹性酶(NE)与ECM结合并降解，从而形成中性粒细胞胞外陷阱(NETs)导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管肺发育不良(BPD)的特征[20]。这些发现表明Exo在生理和病理过程中具有明显的多功能性。因此，Exo是一种理想的生物标志物。在此，笔者总结了癌症中已知的exo-miRNA生物标志物[21]，见表1。

表1 肿瘤来源与相同细胞类型非肿瘤细胞的Exo相比

2 circRNAs

2.1circRNAs起源与特征 人类基因组超过70%是主动转录的，但蛋白质编码基因只占人类基因组的1%～2%，而绝大多数转录本是ncRNA[22]。ncRNA可以分为两个子类[23]，即管家ncRNA(rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA)和调节型ncRNA。调节型ncRNA按长度分类如下：(1)短链非编码RNA(<200 bp)，包括miRNA、snRNA、piRNA、siRNA和其他；(2)长链非编码RNA(lncRNA，> 200 bp)。在lncRNA中，circRNAs最近作为一类新的竞争性内源RNA(ceRNA)出现，它们形成了一个共价闭合的连续环，没有5′帽和3′尾巴，并广泛存在于哺乳动物细胞中。20多年前，NIGRO等[24]在鉴定候选肿瘤抑制基因的剪接转录本中发现了circRNAs。然而，这种新型的RNA产物被认为是由于没有功能的剪接错误导致的。由于高通量测序的快速发展，已经发现了许多circRNAs，并且发现了它们的一些特性。首先，circRNAs似乎在组织或发育阶段特异性表达[25]。其次，在体内，circRNAs比相关的线性mRNA更稳定，因为它们对RNase活性具有抗性[25-26]。第三，来自人类成纤维细胞中超过14%的活跃转录基因的circRNAs，在某些情况下，其丰度比相关线性mRNA的丰度高10倍以上[26]。第四，circRNAs主要存在于细胞质中，但是有些似乎富集在细胞核中[25-27]。circRNAs是一类新的ncRNA生物标志物，在循环过程中具有抗外切酶降解和增强稳定性的特点。根据各种生物遗传模式，circRNAs可以分为以下三类：外显子circRNA(EcircRNA)[26]、环状内含子RNA(ciRNA)和外显子-内含子circRNA(EIciRNA)。

2.2circRNA功能 circRNAs的几种潜在功能[25]包括：(1)通过与ceRNA竞争，再与miRNA结合，称为miRNA海绵；(2)通过内含子ciRNA和EIciRNA促进基因转录；(3)与蛋白质相互作用；(4)被翻译成蛋白质或多肽。

2.2.1circRNAs作为miRNA海绵 作为miRNA海绵是circRNA分子最常见的功能。研究表明，miRNA可以与circRNA结合并失活。结合位点是靶向mRNA的3′非编码区(3′UTR)上的互补位点。一个circRNA可以捕获多个miRNAs，这意味着每个circRNA具有多个miRNAs目标位点。研究发现，小脑变性相关蛋白1反义转录本(CDR1as)可以充当miR-7a/b的海绵[28]。CDR1as包含74个miR-7的结合位点，并且可以负调控miR-7的功能。CDR1as过表达时，大量miR-7与CDR1as结合，导致miR-7的靶基因表达被上调。相反，miR-7的靶基因将在CDR1as下调后被下调。睾丸特异性circRNAs性别决定区域Y基因(SRY)可能具有与CDR1as类似的特征和功能，与miR-138有16个靶位，可作为miR-138海绵。在过去的几年中，越来越多的海绵模型出现。在此，笔者总结了一些常见的充当miRNA海绵的circRNAs[21]，见表2。

表2 circRNAs作为miRNA海绵

2.2.2circRNAs作为调节转录因子 一些EIciRNA通过与U1 snRNA相互作用来调节基因的表达。EIciRNA和U1 snRNP形成的EIciRNA-U1 snRNA化合物与RNA聚合酶Ⅱ复合体相互作用，促进基因表达。通过RNA和DNA调节模型，在拟南芥中发现了SEPALLATA3(SEP3)蛋白，其是从SEP3基因外显子生成的circRNA，并且该circRNA影响相应的同源mRNA剪接。SEP3与相应的DNA序列稳定结合，产生RNA和DNA杂交，从而暂停转录，提高RNA剪接因子并形成可变剪切。

2.2.3circRNAs与蛋白质相互作用 circRNAs可以与Argonaute(AGO)蛋白、RNA聚合酶Ⅱ和RNA结合蛋白(RBP)结合。SALZMAN等[29]研究证明，circRNAs CDR1as可以通过光活性增强的核糖核苷交联和免疫共沉淀(PAR-CLIP)与AGO紧密结合。ci-ankrd52、circEIF3J，以及与聚腺苷酸结合蛋白相互作用的circPAIP2蛋白可以与RNA聚合酶Ⅱ结合。

2.2.4circRNAs作为蛋白质/肽翻译器 circ-ZNF609与重聚体相关，可被翻译成蛋白质[30]。但是，蛋白质翻译的效率与其对应的线性RNA不同，线性RNA的效率是circ-ZNF609的2倍。另一项研究表明，circRNAs可以直接翻译成多肽，他们分析了果蝇脑组织中的核糖体印迹，发现一些circRNAs可以整合到核糖体中[31]。通过一些验证测试，他们认为某些circRNAs可以翻译成蛋白质。核糖体印迹分析表明，该circRNAs(circMbl)的终止密码子与核糖体结合，并在蛋白质谱中发现circMbl编码的蛋白质。

2.2.5circRNAs与癌症 研究表明，circRNAs与人类多种疾病相关，例如，动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病及癌症等[32]。在分析6种人类正常组织(脑、心脏、肺、肝、结肠和胃)和7种人类癌症(膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌、胃癌、大肠癌、肾透明细胞和前列腺癌)超过27 000个circRNAs候选基因的测序数据。与正常组织相比，circRNAs通常在肿瘤组织中下调，而且circRNAs水平与临床特征明显相关，包括分期、年龄、性别和远端转移，这归因于恶性肿瘤反向剪接机制的错误——miRNA的异常调节(由于癌组织中circRNAs的降解，或由于细胞增殖增加而导致的circRNAs减少)。

2.2.6circRNAs介导肿瘤免疫监视 与癌症相关的免疫反应可以通过破坏癌细胞或抑制癌细胞的生长来保护宿主。另一方面，它们还可以通过选择肿瘤逃逸变异或在肿瘤微环境(TME)内建立促进肿瘤特异性、适应性免疫应答发展的条件来促进肿瘤进展。近年来，已发现circRNAs在调节肿瘤免疫力中起潜在作用。作为免疫系统抗原，外源纯化的circRNAs可以通过体外激活视黄酸诱导型基因1(RIG-1)介导的途径来调节先天免疫的激活[33]。circRNAs诱导的RIG-1是众所周知的先天免疫调节剂[34]，并且已证明RIG-1激动剂可以激活抗癌免疫反应来对抗肿瘤[35]。因此，进入肿瘤细胞的外源性circRNA具有影响RIG-1和激活抗肿瘤免疫力的潜力。

2.2.7circRNAs作为癌症转录因子 某些circRNAs可以增强其亲本基因的转录，从而抑制或促进癌症进展。例如，过表达微小染色体维持蛋白(MCM5)与大肠癌和口腔鳞状细胞癌有关，提示不良预后[36]。反之，沉默信息调节因子(SIRT7)的低表达与胰腺导管腺癌(PDAC)的侵袭性肿瘤表型和预后不良有关[37]。cZNF292可通过降低cyclin A、p-CDK2、CDK2、β-catenin、p-STAT3(Tyr705)和p-STAT5(Tyr694)的表达来抑制神经胶质瘤细胞的增殖和血管形成。下调cZNF292导致E2F1、NF-κB、Sp1、HIF-1、AP-1、STAT3和STAT5的转录降低，从而抑制了肿瘤细胞的血管生成[38]。因此，被认为是另一种剪接异构体的circRNA可能在调节基因表达中起关键作用，从而导致癌症相关基因的表达失调。

2.2.8circRNAs作为潜在的癌症生物标志物 circRNAs具有跨物种高度保守的特征，在唾液、血液和Exo中稳定表达，并具有组织或发育阶段的特定特性，故可以满足潜在的癌症生物标志物的要求。与浓度较低的miRNA相比，circRNA更容易被检测。另外，与通过抗原-抗体反应检测蛋白质相比，通过反转录PCR(RT-PCR)和原位杂交检测circRNA的方法更加灵敏和特异。因此，circRNA可能具有充当潜在癌症生物标志物的优势。在不同的癌症中已经有多种circRNAs被认为是潜在的生物标志物。

胃癌的相关研究发现，circ_002059在胃癌组织中下调，其表达水平失调与性别、年龄、TNM和远处转移显著相关[39]。WAN等[40]发现，与癌旁组织相比，70%的肺癌组织中circ-ITCH的表达明显降低。YAO等[41]证实，在非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤组织中，circ_100876明显上调，其过表达水平与淋巴结转移及肿瘤分期密切相关。在结直肠癌细胞系SW480和HCT116的研究中，证明了miR-7、miR-20a和miR-214的circ-ITCH海绵活性[42]。circ_001569也被证明在结直肠癌中的表达水平高于正常组织。有研究还发现，结直肠癌组织具有高水平的circ-BTG3相关核蛋白(BANP)[43]。GUO等[44]研究证明，circ_0000069在CRC中也呈过表达。circ_001059、circ_000167、circ_0067934和circ-ITCH等circRNAs的表达水平与食管鳞状细胞癌(ESCC)的癌症相关病死率有关。在乳腺癌相关研究中，发现circ Foxo3在肿瘤患者标本和一组癌细胞中下调，而当诱导细胞凋亡时，其在癌细胞中呈高表达水平。circ Foxo3在乳腺癌细胞系和乳腺肿瘤组织中明显下调。HCC组织中有61种差异表达的circRNAs，且circ_0005075可能作为miRNA海绵抑制miR-23b-5p在癌症中的表达。另一研究证明，circ_0001649在HCC组织中表达明显降低[45]。此外，Cdr1as在HCC组织中明显上调[46]。高通量分析发现，circ-NT5C2在骨肉瘤中表达异常，通过调控miR-448的表达促进肿瘤细胞的进展和代谢[47]。此外，低表达的circ-PVT1降低了经典的多药耐药相关基因ATP结合盒B亚家族1转运蛋白基因的表达，这表明circ-PVT1在诊断骨肉瘤方面可能比碱性磷酸酶更有效[48]。综上，人类癌症中异常表达的circRNAs可作为人类一类新的诊断、预后和治疗性生物标志物。

3 exo-circRNAs

3.1exo-circRNAs的起源 circRNAs被证明存在于Exo中，这一发现为circRNAs的研究开辟了新的方向。circRNAs多位于细胞质中，并且Exo中circRNAs的种类根据不同类型的细胞质类型有所不同，这表明特定circRNAs转移至Exo的过程可能受到积极调控，这是一个选择性过程。既往研究发现，circRNAs转移至Exo可能存在两种作用机制：一种是细胞之间的交流方式，因为Exo中的物质使远端细胞的物质、信息交流更方便；另一种是Exo中的circRNA可帮助去除细胞中积累的circRNA[49]。

3.2exo-circRNAs作为生物标志物 目前，在各类肿瘤的早期诊断、手术方法、放疗及化疗等方面取得了一定的临床进展，然而，一些肿瘤的早期症状并不典型，最终的诊断往往需要复杂的组织活检，这对患者来说是痛苦的。目前临床上仍缺乏快速、准确、无创的早期诊断生物标志物。

众所周知，大多数类型细胞可分泌一种称为Exo的内溶酶体起源的纳米级EVs，内含特定负载的mRNA、miRNA和蛋白质，能够影响细胞行为，并可能用于诊断多种人类疾病。有研究证实，Exo中存在几种具有潜在生物学功能的circRNAs，特别是人类血清Exo已被证明含有超过1 000个circRNAs，这可能是由于肿瘤中circRNAs进入血流所致[50]。研究血清exo-circRNAs的存在和表达水平可以将癌症患者与健康个体区分开，从而确定新的潜在的基于Exo的癌症生物标志物。有研究通过RNA 测序鉴定了Exo中的RNA群体，包括circRNA、lncRNA、miRNA、mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、snRNA、snoRNA和piRNA等[51]。这些RNA可以从亲代细胞转移到靶细胞，在那里它们调节靶基因或作为蛋白质合成的模板。Exo还可充当miRNA的纳米载体，并在癌症进展中起双重作用。研究发现，circRNAs在癌症Exo中稳定富集，Exo对circRNAs等核酸的转运保护了核酸在细胞外空间免受降解和稀释的保护，从而允许通过血流或组织液进行长距离分布[52]。

由于Exo中含有丰富的circRNAs，它们可以被人类血液收集。为了检测exo-circRNAs是否进入血液循环并可量化用于癌症诊断，在荷瘤小鼠的血清中Exo中检测到了人circRNA-CDYL，并且在异种移植小鼠中发现这种circRNA-CDYL的量与肿瘤发展相关，进一步证明circRNAs可做癌症的早期诊断生物标志物[49]。

3.3exo-circRNAs的检测方法 许多常用的分子生物学技术已经被应用于exo-circRNAs的检测，目前主要技术包括：RT-PCR、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、微滴式数字PCR(ddPCR)、Northern blotting、微阵列(Microarrays)、RNA测序(RNA Sequencing)、NaroString Technologies nCounter等。每一项技术都有各自的优缺点，见表3。

表3 exo-circRNAs的主要检测方法

3.4exo-circRNAs在癌症中的作用 有研究在KRAS突变状态不同的3种同基因结直肠癌细胞系的细胞和Exo中发现，circRNAs在KRAS突变的结直肠癌中被下调，并且可以在Exo中分泌。在HCC中，circRNA_100284随着恶性转化细胞的Exo中释放，并转移到邻近的正常细胞中，促进肝细胞异常增殖。一些来自脂肪组织的exo-circRNAs可以影响HCC中的去泛素化，尤其是在体脂率较高的患者中，存在更多的外环去泛素化(circ-DB)[53]。在胃癌研究中，发现血浆中一种名为ciRS-133的exo-circRNA与白色脂肪组织(WAT)的褐变和癌症相关的恶病质密切相关[54]。PDAC是最具有侵略性和致命性的癌症之一，其5年生存率低至5%，这是由于转移和复发的高风险所致[55-56]。研究人员在Exo介导的circRNAs在PDAC中作用机制研究中，通过芯片分析，circ-PDE8A在PDAC中是一种高表达的circRNA[57]。一项研究表明，circ-PRMT5可以作为miR-30c海绵促进膀胱尿路上皮癌细胞EMT，从而增强其靶基因SNAIL1和E-cadherin的表达，使细胞更具侵袭性[58]。XU等[59]通过RNA-seq技术分析circRNAs在子宫内膜癌患者和健康个体血清中分离出的Exo中的表达情况，发现与健康受试者相比，子宫内膜癌患者Exo中上调circRNAs的数量高于下调circRNAs的数量。以上研究数据表明，源自人类癌症的circRNAs可以进入血液，并易于在血清中定量，而exo-circRNAs可以影响靶细胞，有助于识别癌症发展的新机制。

5 小结与展望

对RNA领域的不断深入研究表明，circRNAs在生理和病理过程中起着重要的作用。尽管关于circRNAs的研究很多，但是其形成机制和清除机制仍不清楚。作为纳米级的生物囊泡，Exo仍被认为是“粗糙的钻石”，其携带了特殊的蛋白质和RNA序列，可以作为细胞间信息交换的新方法，从而促进细胞间的通信。由于其独特性和高特异性，Exo与circRNAs结合可以增加其作为癌症早期诊断和预后标志物的潜力，而且它们可以作为许多疾病的生物标志物。生物标志物是血液、组织和体液中含有的生物分子，可以作为正常和病理状态的客观评价和测量指标[60]。生物标志物的使用对于不同疾病的早期检测和诊断以及对治疗反应的监测具有很重要的临床意义[61]。这些生物标志物的典型特征，如稳定性、敏感性和特异性，使其能够在临床实践中得到应用。

精准医疗尤其是液体活检的目标是发现癌症生物标志物。这些生物标志物对癌症风险指征具有较强的监测能力，有助于患者接受最合适的治疗，并有助于临床医生监测疾病的进展或复发。研究表明，Exo是癌症诊断预后和预测的潜在生物标志物，Exo用作生物标志物的目的是与全身体液相比，大大降低了样品的复杂性，并且在液体活检中具有微创性，甚至是无创性[62]。此外，由于Exo具有良好的生物分布和生物相容性，为了成功地开发治疗癌症的渐进治疗方法，尤其是精准医疗，exo-circRNA应是治疗靶标的一种选择。尽管如此，与Exo lncRNA和miRNA相比，目前对circRNAs与Exo之间关系的了解仍然存在许多空白，例如，exo-circRNA在体液中传递的机制，以及exo-circRNAs在癌症中的作用。阐明与人类癌症相关的exo-circRNAs的功能和分子机制将开辟新的认识途径，为恶性肿瘤的诊疗提供新的方法。