强直性脊柱炎患者外周血miR-132、IL-17的表达及临床意义*

2020-10-14郭团茂杨争光陈忠宁行艳丽朱海云

国际检验医学杂志 2020年19期

郭团茂,杨争光，陈忠宁，行艳丽，朱海云

(咸阳市中心医院骨科，陕西咸阳 712000)

强直性脊柱炎(AS)是一种常见的慢性自身免疫紊乱性脊柱疾病，多以骶髂关节炎最先发病，最终导致心肺功能受限的脊柱强直改变。AS是多病因疾病，遗传和环境因素占发病因素的90%，其中50%遗传因素与机体主要组织相容性复合物HLA-B27基因相关[1]。目前，AS的发病机制仍然不十分清楚。近年来发现，miR-132参与了多种炎性疾病的发病机制，包括自身免疫性疾病类风湿关节炎[2-3]。白细胞介素17(IL-17)作为一种炎性介质，在很多免疫紊乱性疾病中有重要作用。目前，miR-132、IL-17与AS的关系尚不清楚。因此，本研究探索了AS患者外周血miR-132及IL-17的表达情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2013年8月至2017年8月在本院门诊及住院的AS患者189例作为AS组。AS诊断符合美国风湿病学会(ACR)1984年纽约标准[4]。(1)双侧或单侧的骶髋关节炎；(2)临床表现符合下列条件之一：①轴性腰背痛时间至少3个月，持续性静息痛，活动后疼痛改善；②腰椎活动度受限，尤以前屈后伸及侧屈明显；③胸廓活动度低于同龄、同性别的正常值。纳入标准：(1)经上述诊断标准确诊的AS患者；(2)血清HLA-B27阳性；(3)红细胞沉降率和C反应蛋白异常的活动期患者。排除标准：(1)近3个月出现感染病史；(2)严重的高血压、糖尿病患者；(3)有恶性肿瘤病史；(4)合并脊柱退变疾病。AS组患者中，男152例，女37例；年龄19～56岁，平均(29.8±6.1)岁；病程6个月至20年，平均(6.6±1.4)年。另选取同期在本院体检的健康志愿者105例作为对照组，其中男84例，女21例；年龄25～45岁，平均(30.7±3.6)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会审议批准，所有研究对象均知情研究内容并签署同意书。

1.2仪器和试剂 9701型梯度荧光PCR仪购自南京赛飞生物科技有限公司，SM800型多功能酶标仪购自上海永创医疗器械有限公司。Ficoll分离液购自上海生工生物工程股份有限公司，总RNA提取所用Trizol试剂、RNase-free水购自上海杰美基因医药科技有限公司，反转录试剂盒及人IL-17试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1外周血miR-132表达水平的测定采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-132的表达情况。收集每位研究对象清晨空腹外周静脉血3 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，3 000 r/min离心5 min。采用Ficoll分离液外周静脉血分离单个核细胞(PBMC)，然后加入Trizol试剂1 mL充分裂解细胞，提取PBMC的总RNA，最后加入15 μL的RNase-free水溶解沉淀。根据反转录试剂盒说明书进行反转录cDNA操作。参照Genbank数据库及miRBase数据库中的基因序列，使用软件Primer5.0设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。RT-qPCR反应条件：95 ℃预变性30 s，然后按以下条件循环40次：变性95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s/72 ℃ 30 s。miR-132的相对表达水平以U6为内参照，将目标基因的Ct值与内参基因的Ct值做对比，计算基因mRNA的相对表达量[5]。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.2血浆IL-17表达水平的测定取制备的研究对象血浆标本于室温下复融，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测研究对象血浆中IL-17的表达水平。严格按照人IL-17 ELISA试剂盒说明书操作步骤实施。

2 结果

2.1两组外周血miR-132及IL-17表达水平比较 AS组患者外周血miR-132及IL-17表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组外周血miR-132及IL-17表达水平比较

2.2AS组患者外周血miR-132、IL-17的相关性 Pearson相关分析结果显示，miR-132、IL-17呈正相关(r=0.713，95%CI：0.635～0.777，P<0.01)。

2.3外周血miR-132诊断AS患者的ROC曲线外周血miR-132 诊断AS患者的ROC曲线见图1，miR-132 ROC曲线下面积为0.931，临界值取2.50，其诊断AS的灵敏度为90.5%，特异度为91.0%。见图1。

图1 外周血miR-132诊断AS的ROC曲线

3 讨论

AS是发生在运动系统的慢性疾病，通常影响脊柱和外周关节，疾病持续性恶化最终严重影响生活质量。资料显示，全世界AS的发病率近年呈上升趋势[6]。由于缺少阻止疾病进展和有效防治方法，AS发病率不断递增[7]。本研究探索了外周血miR-132及IL-17在AS的表达和临床意义。

辅助性T淋巴细胞Th17(CD4+T细胞)分泌炎性因子IL-17，参与多种自身免疫紊乱性疾病的发病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。AS作为自身免疫性疾病，淋巴细胞诱导的炎性反应是疾病的重要因素。栾仲秋等[8]认为，类风湿关节炎患者血清中IL-17明显升高，并且疾病的活动性和IL-17正相关。有研究发现，IL-17诱导银屑病和银屑病性关节炎患者血糖或血脂升高，研究者认为炎性因子导致了自身免疫性疾病中代谢紊乱[9]。在本研究中，AS组患者血浆IL-17的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，验证了张立等[10]的研究结果：早期启动的IL-17炎性因子参与AS发病过程。有学者进一步研究发现，IL-17单抗对活动期AS有良好的治疗效果[11]。提示炎性因子IL-17在AS疾病的发病中起着重要的作用，通过抑制IL-17可以预防和治疗AS。

微小RNA(miR)属于内源性非编码单链小分子RNA，转录后调控靶基因的表达水平。miR-132是发现较早和研究较多的miR，在癌症、神经退变性疾病、炎性疾病、免疫系统疾病中发挥着重要的作用。有研究强调，低表达的miR-132是总体生存率(P=0.001)和无病生存率(P=0.006)的独立预后因素,miR-132与骨肉瘤的发生、发展有关[12]。另外一个研究表明，miR-132在舌鳞状细胞中的表达增加[13]。有学者已经证实，miR-132与miR-223通过调节炎症性肠病中的叉形头转录因子O亚型3a(FOXO3a)控制正反馈回路[14]。有报道表明，青少年特发性关节炎患者血浆中miR-132低于健康人和青少年AS患者[15]。AS是一种慢性炎症性疾病，因此本研究检测了患者外周血miR-132，结果发现miR-132呈高表达，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；同时，miR-132与IL-17水平呈明显正相关(r=0.713，P<0.05)。ROC曲线分析显示，miR-132诊断AS的灵敏度和特异度较高，结果表明miR-132可以视为活动性AS血液中潜在的生物标志物。