豆天蛾蛹蛋白水解液饮料的研制

赵国秀，杨鑫茹，孙广仁，刘艳秋

（北华大学林学院，吉林吉林132013）

昆虫作为自然界最庞大的群体，如黄粉虫[1]、蚕蛹[2-4]、蚯蚓、竹蜂、蚂蚱、蜂蛹等，因体内含有丰富的蛋白质、脂肪及其他营养物质逐渐走进人们的视野[5-6]，被越来越多的人接受。此外，饲养、收获和加工昆虫蛋白的消耗和对环境的影响也要远远小于传统的蛋白质来源[7]。

目前全球被发现的昆虫品种已达1 000万，已知可食用的昆虫也已达3 650多种。对此，联合国粮食及农业组织曾在2013年发表报告倡导将昆虫作为未来主要的食品来源，这一倡导也使得全球昆虫食品行业进入前所未有的发展黄金期。

豆天蛾（Clanis bilineata tsingtauiica Mell）又称大豆天蛾或豆青虫，不仅拥有高于鸡蛋、牛奶、大豆的蛋白质含量，还含有丰富的不饱和脂肪酸，其中以亚麻酸为主。幼虫中海藻多糖的含量更是哺乳动物的10倍以上，还含有丰富的VE、VB1、VB2等多种维生素以及 K、Zn、P等矿质元素，可以有效延缓衰老[8]、降低血脂、血压、抗癌和提高智力等。柠檬（Citrus lemon L.）富含多种功效成分如柠檬酸[9]、类黄酮[10-12]、D-柠檬烯[13-16]，可以有效提高人体免疫力，预防癌症、坏血症、心脏病、中风、心血管硬化和口腔溃疡[17-19]等多种慢性疾病。尤为重要的是，柠檬所提供的独特芳香气味可以很好的掩盖豆天蛾食品带来的虫腥味。

本文正是基于柠檬对豆天蛾蛹气味良好的遮蔽效果，通过单因素和正交试验确定豆天蛾蛹最佳的酶解反应条件，再进行配方优化，最终制得一款富含氨基酸的果汁饮料，为昆虫食品行业的进一步发展提供了崭新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干豆天蛾蛹、柠檬：市售；风味蛋白酶（10万U/g）：浙江一诺生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

SOX406型脂肪测定仪：海能仪器股份有限公司；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱、HWS-12型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；TU-1810型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；ME204型电子天平：格特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-24 M型离心机：湖南湘鑫仪器仪表有限公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁公司；JYL-CO2 OE型破壁机：九阳股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 指标检测方法

1.3.2.1 理化指标

氨基酸态氮含量按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》检测；葡萄皮及VC的DPPH自由基清除率的测定参考郭文莉[16]的方法进行。

1.3.2.2 感官指标

设计豆天蛾蛹饮料的感官评定标准，确定其感官评价由色泽、香气、滋味和组织状态4个因素组成。选取30人小组进行评分，总分设定为100分，其中包括色泽30分、虫味遮蔽效果40分、滋味15分以及组织状态15分。评定标准见表1。

表1 豆天蛾蛹饮料感官评定标准Table 1 Sensory evaluation criteria for pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.3 豆天蛾蛹脱脂率的确定

以乙醚为溶剂，使豆天蛾蛹粉在40℃下索氏提取4 h，烘干后称量粉重，确定豆天蛾蛹中脂肪含量。

1.3.4 豆天蛾蛹酶解条件的确定

1.3.4.1 豆天蛾蛹酶解条件的单因素试验

分别研究豆天蛾蛹粉的加入量（0.01、0.05、0.09、0.13、0.17 g/mL），酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），酶解温度（35、40、45、50、55 ℃），酶解 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），酶解时间（2、4、6、8、10 h）对豆天蛾蛹酶解效果的影响。

1.3.4.2 豆天蛾蛹酶解条件的正交试验

在单因素结果的基础上，分别以酶用量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间，进行正交试验，以氨基酸态氮的含量为检测指标，确定豆天蛾蛹最佳的水解反应条件。其因素水平表见表2。

1.3.5 水解液DPPH自由基清除率的测定

在最佳的水解反应条件下将干豆天蛾蛹粉进行水解，调配试剂。在25℃下避光反应30 min，并在517 nm处进行测定，做3组平行试验，并计算清除率。

式中：Ai为1 mL水解液加入2 mL DPPH的吸光度；A0为2 mLDPPH加入1 mL50%乙醇的吸光度；A2为1 mL水解液加入2 mL50%乙醇的吸光度。

表2 豆天蛾蛹酶解条件正交试验的影响因素及水平Table 2 Influencing factors and levels of orthogonal test on enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

1.3.6 豆天蛾蛹饮料最佳配方的确定

1.3.6.1 豆天蛾蛹饮料配方的单因素试验

分别研究水解液与柠檬汁体积比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5），浓缩汁与水的体积比（4 ∶6，4 ∶7，4 ∶8，4 ∶9，4∶10），白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%），黄原胶添加量（0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%），羧甲基纤维素钠添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）对豆天蛾蛹饮料感官评分的影响。

1.3.6.2 豆天蛾蛹酶解条件的正交试验

在单因素结果的基础上，分别以浓缩汁与水的比例、白砂糖添加量、黄原胶添加量、羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na） 添加量，进行正交试验，以感官评价为依据，确定豆天蛾蛹饮料的最佳配方，其因素水平表见表3。

表3 豆天蛾蛹饮料最佳配方正交试验的影响因素及水平Table 3 Influencing factors and levels of orthogonal test for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

2 结果与分析

2.1 豆天蛾蛹的脱脂率测定结果

将豆天蛾蛹粉碎后，在40℃下进行索氏提取4 h，烘干后称量粉重，计算得脱脂率约为21.58%。

2.2 豆天蛾蛹酶解条件的确定

2.2.1 豆天蛾蛹粉添加量的确定

不同豆天蛾蛹粉添加量对氨基酸态氮含量的影响见图1。

根据图1的曲线可以看出，豆天蛾蛹粉的添加量从0.01 g/mL至0.13 g/mL时，随着添加量增加，水解液中氨基酸态氮含量逐渐增加。当豆天蛾蛹粉的添加量为0.13 g/mL时，氨基酸态氮含量为1.97 g/L。但豆天蛾蛹粉的添加量高于0.13 g/mL时，氨基酸态氮含量下降，可能底物过多使酶解反应不完全。

图1 不同豆天蛾蛹粉添加量对氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effect of different addition amounts of Clanis bilineata tsingtauica Mell powder on amino acid nitrogen content

2.2.2 酶用量的确定

不同酶用量对氨基酸态氮含量的影响见图2。

图2 不同酶用量对氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of different enzyme additions on amino ccid nitrogen content

如图2所示，当酶用量在0.1%至0.5%，随着酶用量增加，氨基酸态氮的含量不断增高。当酶用量超过0.5%时，氨基酸态氮的含量开始下降。产生的原因可能是随着酶用量的不断增加，产物不断增多，会抑制底物的反应。

2.2.3 酶解温度的确定

不同酶解温度对氨基酸态氮含量的影响见图3。

图3 不同酶解温度对氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on amino acid nitrogen content

如图3所示，当酶解温度在35℃至50℃，随着酶解温度的提高，氨基酸态氮含量增加，当酶解温度为50℃时，氨基酸态氮含量可达到2.01 g/L，产生的原因为适当的加热会使蛋白质的酶作用位点暴露，方便与酶更加充分的结合，促使酶解反应完全；而当温度高于50℃时，酶活性受到抑制，氨基酸态氮含量下降。

2.2.4 酶解pH值的确定

不同酶解pH值对氨基酸态氮含量的影响见图4。

图4 不同酶解pH值对氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis pH on amino acid nitrogen content

结果如图4所示，当pH值为6.0时，氨基酸态氮含量为2.22 g/L，酶解反应条件受pH值影响明显，当pH值大于6时酶反应能力减弱，氨基酸态氮生成量减少。

2.2.5 酶解时间的确定

不同酶解时间对氨基酸态氮含量的影响见图5。

图5 不同酶解时间对氨基酸态氮含量的影响Fig.5 Effect of different enzymatic time on amino acid nitrogen content

如图5所示，随着酶解时间的延长，氨基酸态氮的含量不断增加，8 h时氨基酸态氮生成量为2.63 g/L。超过8 h后，氨基酸态氮的含量开始下降。这是因为一方面新产生的产物对底物有抑制作用，另一方面底物在不断减少，酶也会随着酶解时间的延长渐渐变性失活。

2.2.6 豆天蛾蛹酶解条件的正交试验

以各个单因素的最佳条件为中心，上下各选取两个参数进行正交试验。正交试验结果如表4所示。

根据正交试验结果可得出4个单因素对豆天蛾蛹酶解反应影响大小的顺序为：C（酶解pH值）＞A（酶用量）＞B（酶解温度）＞D（酶解时间），即得到的最佳酶解条件为A3B1C2D2。这与单因素试验结果A2B2C2D2和正交试验第7组A3B1C3D2稍有偏差，进行验证试验，再次测定氨基酸态氮的含量，结果见图6。

表4 豆天蛾蛹酶解条件正交试验结果Table 4 Orthogonal test table of enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

图6 豆天蛾蛹酶解最佳条件的确定Fig.6 Determination of the optimum enzymatic hydrolysis conditions of Clanis bilineata tsingtauica Mell

经验证试验可得，最佳的酶解反应条件为酶用量0.5%、酶解温度50℃、酶解pH6.0、酶解时间8 h。

2.3 豆天蛾蛹饮料最佳配方的确定

2.3.1 水解液与柠檬汁体积比的确定

水解液与柠檬汁体积比对感官评分的影响见图7。

结果如图7所示，当水解液与柠檬汁的体积比超过1∶3时，感官评分变化不明显。这是由于当水解液与柠檬汁的体积比为1∶3时，柠檬香气就已经可以完全掩盖水解液虫味，所以后续柠檬汁比例的增加不会对感官评分产生影响。因此，通过试验可以得出柠檬香气对虫味具有遮蔽效应。

图7 水解液与柠檬汁体积比对感官评分的影响Fig.7 Effect of volume ratio of hydrolysate and lemon juice on sensory score

2.3.2 浓缩汁与水体积比的确定

浓缩汁与水体积比对感官评分的影响见图8。

图8 浓缩汁与水体积比对感官评分的影响Fig.8 Effect of volume ratio of concentrated juice and water on sensory score

如图8所示，当浓缩汁与水的体积比为4∶8时，感官评分最高。此时饮料浓稠适宜，无虫味。而当浓缩汁与水的体积比超过4∶8时，味道变淡，品质下降。

2.3.3 白砂糖添加量的确定

白砂糖添加量对感官评分的影响见图9。

图9 白砂糖添加量对感官评分的影响Fig.9 Effect of white sugar addition on sensory score

如图9所示，当白砂糖添加量低于8%时，口感过酸，刺激肠胃，影响身体健康；当白砂糖添加量高于8%时，口感过甜，与现代人低糖的饮食习惯不符。当白砂糖添加量为8%时，感官评分最高。

2.3.4 黄原胶添加量的确定

黄原胶添加量对感官评分的影响见图10。

图10 黄原胶添加量对感官评分的影响Fig.10 Effect of xanthan gum addition on sensory score

如图10所示，当黄原胶添加量为0.05%时，柠檬颗粒的悬浮效果最好，评分最高。这是因为当黄原胶添加量过低时，柠檬颗粒多数沉淀。而当黄原胶添加量高于0.05%时，黄原胶溶解缓慢，会在饮料表面形成白色絮状飘浮，影响感官评定。

2.3.5 羧甲基纤维素钠添加量的确定

羧甲基纤维素钠添加量对感官评分的影响见图11。

图11 羧甲基纤维素钠添加量对感官评分的影响Fig.11 Effects of sodium CMC-Na on sensory score

如图11所示，当CMC-Na添加量为0.10%时，柠檬颗粒完全悬浮，口感最佳，感官评分最高。当CMCNa添加量超过0.10%时，柠檬颗粒悬浮效果无变化，但饮料流动性减弱。

2.3.6 豆天蛾蛹饮料最佳配方的正交试验

以各个单因素的最佳条件为中心，上下各选取两个参数进行正交试验正交试验结果如表5所示。

表5 豆天蛾蛹饮料最佳配方正交试验结果表Table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

续表5 豆天蛾蛹饮料最佳配方正交试验结果表Continue table 5 Orthogonal test table for optimum formulation of pupa beverage of Clanis bilineata tsingtauica Mell

根据正交试验结果可得出4个单因素对豆天蛾蛹饮料最佳配方影响大小的顺序为：F（白砂糖添加量）>G（黄原胶添加量）>E（浓缩汁与水体积比）>H（CMCNa添加量），即得到的最佳饮料配方为E2F2G2H3。这与试验结果E1F2G2H2稍有偏差，进行验证试验。经验证试验得出极差最优组试验所得饮料感官评价较好。

2.4 水解液DPPH自由基清除率的测定

在最佳酶解反应条件下处理豆天蛾蛹粉，得到水解液。再将水解液与葡萄皮、VC以及几种常见蔬果的DPPH自由基清除率进行比较，结果见图12。

图12 水解液与几种常见物质DPPH自由基清除能力的比较Fig.12 Comparison of DPPH scavenging capacity between hydrolysate and several common substances

经3次平行试验可得，豆天蛾蛹水解液DPPH自由基清除率为84.99%。与VC的DPPH自由基清除能力进行方差分析（P=0.09>0.05），结果表明两组数据无差异，说明豆天蛾蛹水解液与VC抗氧化能力相当；与葡萄皮色素的DPPH自由基清除能力进行方差分析（P=0.87>0.05），结果表明两组数据无差异，说明豆天蛾蛹水解液与葡萄皮抗氧化能力相当；与莲藕、番茄的 DPPH 清除能力[16，20]进行方差分析（P<0.05），结果表明两组数据差异显著，说明豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力超过莲藕和番茄。

分析结果表明，豆天蛾蛹水解液具有较强的抗氧化能力，所研发的豆天蛾蛹饮料也具有一定的抗氧化效果。

3 结论

通过试验得出豆天蛾蛹脂肪含量为21.58%，豆天蛾蛹蛋白最佳水解条件为0.13 g/mL的豆天蛾蛹粉、0.5%的风味蛋白酶、在50℃、pH值为6.0的条件下反应8 h，水解液对DPPH自由基的清除率为84.99%；水解液与柠檬汁按1∶3体积比调配成浓缩汁，再将浓缩汁与水按4∶8体积比混合，加入8%的白砂糖、0.05%的黄原胶和0.15%的羧甲基纤维素钠。通过最佳配方试验的分值可以看出豆天蛾蛹水解液的气味可以被掩盖。而且豆天蛾蛹水解液的抗氧化能力较强，对豆天蛾蛹水解液的研究具有现实意义，可以继续深入，开发出更多的豆天蛾蛹系列产品。