离子液体-超声辅助提取葛根黄酮及抗氧化活性研究

宋岩，关桦楠，刘博，龚德状，张娜

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076）

黄酮类化合物是最大的天然酚类产品之一[1]。葛根（puerariae lobatae radix，PLR）是丰富的异黄酮类化合物的来源，异黄酮类化合物的有益作用主要是由于其抗氧化的特性，PLR的营养价值与其异黄酮衍生物密切相关，因此对葛根黄酮的深入研究日益成为人们关注的焦点[2-3]。传统方法通常采用浸渍法、回流法、大孔树脂吸附和酶解法等不同工艺从PLR中分离葛根素、大豆苷、大豆苷元等主要活性成分，或通过微波和超声波进行预处理，或辅助这些常规方法进行工艺优化[4-6]。一般来说，这些传统技术需要大量的挥发性试剂和有害试剂，提取时间长，能耗大、提取率低，限制了其在工业上的应用。因此，开发一种高效安全的新技术应用于食品与制药工业中天然产物的提取具有重要的意义。

超声辅助提取已被证明在辅助植物材料提取过程中可以显著缩短提取时间和提高提取率。在超声应用过程中，会产生空化效应和机械效应，从而使溶剂更容易渗透到植物原料中，破坏植物细胞壁，促进有效成分释放[7-8]。离子液体（ionic liquids，ILs）被称为“设计师溶剂”，可以通过不同阴离子和阳离子的各种偶联进行设计，可溶于水和有机溶剂，萃取能力强，稳定性良好[9-11]。在超声、微波和升高温度等方法辅助下，可进一步提升其提取效果[12]，并在从自然资源中提取类黄酮、酚酸、生物碱、萜类等化合物的应用中取得了成功[13-15]。近年来，超声波/微波辅助萃取技术得到了发展，并在萃取效率、经济成本等方面取得了显著的进展。因此，本文采用离子液体-超声波辅助法，以葛根提取物为原料，以溴化-1-丁基-3-甲基咪唑（1-butyl-3-methylimidazolium bromide，[bmim]Br） 为提取剂，通过正交试验设计优化提取工艺参数，同时对提取物的DPPH自由基清除效果进行研究，为深入探索其综合利用价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

葛根提取物：晨光生物科技集团股份有限公司；葛根素标准品：酷尔化学科技（北京）有限公司；溴化-1-丁基-3-甲基咪唑：上海爱纯生物科技有限公司；95%乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醇：天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司；DPPH：福州飞净生物科技有限公司；抗坏血酸：天津市天力化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

FA2004型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；KQ-250E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TD5A型离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司；UV 5500PC型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 葛根黄酮的提取

采用离子液体-超声波辅助法提取葛根黄酮。

1.2.1.1 标准曲线的绘制

在电子天平上准确称取葛根素5 mg，用95%乙醇配成0.1 mg/mL的标准品溶液，从中精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用去离子水补充至 10 mL。取1.0 mL 95%乙醇加去离子水补充至10 mL作为空白对照溶液。分别在250 nm波长处测定吸光度值，绘制标准曲线图，得到吸光度与葛根素浓度的回归方程为y=72.834x+0.059 1，相关系数R2=0.997 4。在0～0.03 mg/mL范围内呈良好的线性相关。

1.2.1.2 葛根黄酮提取量的测定

准确称取一定质量的葛根提取物，按一定固液比加入[bmim]Br，在一定温度、功率和时间下，进行超声波辅助提取，将提取液离心取上层清液。在250 nm处测定样品中总黄酮所对应的吸光度值后，根据葛根素标准曲线，计算葛根黄酮提取量。计算公式如下：

式中：C为提取液中葛根黄酮的浓度，mg/mL；V为提取液定容体积，mL；M为葛根提取物质量，g。

1.2.2 单因素试验

1）固液比对葛根黄酮提取量的影响：称取0.5 g葛根提取物，按固液比1 ∶2、1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶30（g/mL）加入浓度为0.5 mol/L的离子液体，在温度为70℃，超声功率250 W，超声作用时间25 min的条件下提取，考察固液比对黄酮提取量的影响。

2）离子液体浓度对葛根黄酮提取量的影响：称取0.5 g葛根提取物，按固液比1∶10（g/mL）加入浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L 的离子液体，在温度为70℃，超声功率250 W，超声作用时间25 min的条件下提取，考察离子液体浓度对黄酮提取量的影响。

3）超声作用时间对葛根黄酮提取量的影响：称取0.5 g葛根提取物，按固液比1∶10（g/mL）加入浓度为0.5 mol/L的离子液体，在温度为70℃，超声功率250 W，超声作用时间 10、15、25、30、35、40 min 的条件下提取，考察超声作用时间对黄酮提取量的影响。

1.2.3 正交优化试验

在单因素试验的基础上，以固液比、离子液体浓度、超声作用时间为试验因素，进行正交优化试验确定离子液体-超声波辅助法提取葛根黄酮的最优工艺参数。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定

采用最优工艺参数提取葛根样品中的黄酮，用去离子水稀释提取液得到质量浓度为 10、20、40、60、80、100 μg/mL的葛根黄酮溶液，各取2.0 mL于10 mL具塞刻度试管中。加入 0.04 g/L用无水乙醇配制的DPPH溶液2.0 mL，摇匀避光静置30 min，离心后取上清液作为试验组，于517 nm波长处测出吸光度值A1。再测出对照组（用2.0 mL无水乙醇替代试验组中2.0 mL DPPH溶液）以及空白组（用2.0 mL无水乙醇替代试验组中2.0 mL各浓度黄酮溶液）的吸光度值分别为A2、A0。按下式计算出DPPH自由基清除率：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 固液比对葛根黄酮提取量的影响

保持其它因素条件不变，不同水平的固液比对葛根黄酮提取量的影响如图1所示。

图1 固液比对葛根黄酮提取量的影响Fig.1 The influence of soild-to-liquid ratio on the content of pueraria flavones

从图 1 可以看出，固液比 1 ∶2（g/mL）～1 ∶15（g/mL）范围内，随着离子液体用量的增加，黄酮提取量从607.02 mg/g提高到702.39 mg/g。而当固液比为1 ∶15（g/mL）～1 ∶30（g/mL），黄酮提取量呈下降趋势。得率提高的原因是较大的溶剂体积使得样品与溶剂间的有效成分浓度差变大，可以加速萃取过程中的传质，促进更多黄酮在溶质介质中的扩散，而超声场中的湍动效应也使得固液界面中传质边界层变薄，从而增强了扩散推动力，提高了提取效率[16]。但当固液比达到1∶15（g/mL）后，由于单位体积的料液接收的超声能量变小，反而不利于黄酮的提取。因此，选择合适的固液比为 1 ∶15（g/mL）。

2.1.2 离子液体浓度对葛根黄酮提取量的影响

保持其它因素条件不变，不同水平的离子液体浓度对葛根黄酮提取量的影响如图2所示。

由图2可知，当离子液体浓度从0.1 mol/L提高至0.25 mol/L，提取液浓度的增加更容易萃取黄酮类化合物，黄酮提取量从506.24 mg/g提升至649.94 mg/g，大幅增加。当[bmim]Br浓度由0.25 mol/L增加至0.5 mol/L，提取量随之增加，但幅度较小，这说明即使继续提高提取液浓度，黄酮提取量也不会有很大提高。继续增大[bmim]Br浓度，当浓度大于0.5 mol/L后，浓度的增加会导致提取液黏度的明显增大，可能会影响超声过程中空化效应的作用，黄酮提取量呈下降趋势，浓度达到1.0 mol/L，黄酮提取量趋于平稳。因此本试验中0.5 mol/L是比较理想的提取液浓度。

图2 离子液体浓度对葛根黄酮提取量的影响Fig.2 The influence of ionic liquid concentration on the content of pueraria flavones

2.1.3 超声作用时间对葛根黄酮提取量的影响

保持其它因素条件不变，不同水平的超声作用时间对葛根黄酮提取量的影响如图3所示。

图3 超声作用时间对葛根黄酮提取量的影响Fig.3 The influence of ulatrasonic action time on the content of pueraria flavones

由图3可见，在超声作用时间为25 min时，黄酮提取量达到最大。当超声时间从10 min增加至25 min，黄酮提取量增加且幅度较大，这是由于超声初期空化作用在一定程度上破坏了葛根的细胞壁，加之超声场聚能效应和高温条件的存在，适当地延长提取时间使目标化合物溶出更加充分。当时间由25 min延长至30 min，溶剂中细胞内外的浓度差达到平衡，而细胞内其他杂质的溶解也会影响黄酮的浸出，黄酮提取量呈缓慢下降趋势。黄酮类化合物本身具有抗氧化性，在温度70℃的条件下，当超声作用时间达到35 min时，可能存在氧化破坏和蒸煮损失，提取量大幅下降。因此，选择超声作用时间为25 min。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，对固液比、离子液体浓度、超声作用时间3个因素进行正交试验，不考虑因素间的交互影响。正交试验因素水平如表1所示，正交试验结果如表2所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal experiment

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

由表2中R值看出，各因素对葛根黄酮提取量的影响大小顺序依次为：D＞B＞A，即超声作用时间＞离子液体浓度＞固液比，其中超声作用时间、离子液体浓度、固液比的极差均大于空白列的极差，说明这3个因素对葛根黄酮含量都有影响。通过分析可知，离子液体-超声波辅助法提取葛根黄酮较佳的提取条件为：A1B2D3，即固液比 1 ∶10（g/mL）、离子液体浓度 0.5 mol/L、超声作用时间30 min。在最优提取条件下进行验证试验，测得葛根黄酮提取量为774.95 mg/g，高于正交表中最优的试验结果，优选案与试验分析结论相符。

2.3 抗氧化活性研究

植物黄酮对自由基具有一定的清除能力。葛根黄酮提取物对DPPH自由基清除率如图4所示。

图4 DPPH自由基清除率Fig.4 The scavenging rate to DPPH radical

由图4可知，以VC为阳性对照，一定浓度的黄酮提取物对DPPH自由基具有较强的清除能力，且其清除自由基的能力随葛根黄酮质量浓度的提高而增强，量效关系良好。葛根黄酮的多环多酚结构具有自由基捕获能力，当提取物浓度达到80 μg/mL和100 μg/mL时，清除率分别达到了67.7%和78.2%。

3 讨论与结论

离子液体-超声辅助提取是一种高效、绿色的提取方法，超声空化效应和热效应的辅助促进了有效成分的溶出，节省时间，降低能耗的同时，提高了葛根黄酮的提取量。本试验对离子液体-超声辅助提取中的固液比、离子液体浓度和超声作用时间3个因素进行正交试验条件优化，最优工艺条件为：固液比1∶10（g/mL）、离子液体浓度0.5 mol/L、超声作用时间30 min。在此条件下，葛根黄酮提取量为774.95 mg/g。并考察了葛根黄酮提取物的抗氧化活性，结果表明一定浓度的黄酮提取物对DPPH自由基具有显著的清除能力。与传统方法相比提取过程简单，省时，且成本较低，为葛根的综合利用提供参考。