冻干地黄、生地黄HPLC 指纹图谱

谭丽媛，陈 瑾，王旭文，翟康欣，李 敏，张淑蓉*

（1.山西中医药大学中药学院，山西 晋中 030600；2.山西振东安特生物制药有限公司，山西 晋中 030600）

地黄是玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.新鲜或干燥的块根［1］，始载于《神农本草经》，被列为上品。生地黄味甘、性寒，具有养阴生津、清热凉血的功效，现代药理研究表明其具有保护心血管系统、抗肿瘤、抗炎等作用，在临床上应用广泛［2］。地黄主产于河南、山西、河北、辽宁、山东等地，历来以河南产怀地黄为道地药材；因地黄忌连作，与河南一河之隔的山西近年来成为地黄主产地之一。真空冷冻干燥所得冻干地黄不易变质，能更有效保留地黄的活性成分［3］，虽真空冷冻干燥设备投资成本高，但长期应用效率高且能耗低，山西省中药材、中药饮片地方标准拟收载冻干地黄炮制品。本实验以梓醇、地黄苷A、毛蕊花糖苷等为参照，对同批鲜地黄炮制所得冻干地黄和生地黄进行HPLC 指纹图谱研究，以期为地黄炮制品的质量控制和评价提供依据。

1 材料

Waters 高效液相色谱仪（515 泵、2996 检测器，2695泵、2998 检测器，Empower 工作站，美国Waters 公司）；SB-800 DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；AB135-S 分析天平（十万分之一，瑞士Mettler Toledo公司）；CP214 分析天平（万分之一，上海舜宇平科学仪器有限公司）。

地黄药材产地为山西、河南，经山西中医药大学裴香萍副教授鉴定为正品。梓醇（批号110808-200104）、毛蕊花糖苷对照品（批号111530-201208）均购于中国食品药品检定研究院；地黄苷A 对照品（批号20120317）购于宝鸡市辰光生物科技有限公司。水为双蒸水，乙腈（色谱纯，批号12960217，瑞典欧森巴克化学公司）；磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil ODS2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长205 nm；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取梓醇、地黄苷A、毛蕊花糖苷对照品，加20%甲醇制成每1 mL 分别含梓醇0.87 mg、地黄苷A 1.25 mg、毛蕊花糖苷0.48 mg 的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 分别取冻干地黄粉末（过2 号筛）、生地黄（取生地黄切成小块约5 mm，经减压干燥80 ℃，24 h 后，磨成粗粉）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密量取，称定质量，摇匀，冷浸过夜（12 h），超声（功率250 W，频率35 kHz）处理1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，水浴蒸至近干，20%甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，并用20%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得［4-6］。

2.3 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样，记录120 min 的色谱图。

表1 梯度洗脱程序

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取冻干地黄样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录高效液相色谱图，通过相似度评价软件计算相似度，结果均大于0.99，表明仪器精密度良好［7-9］。

2.4.2 稳定性试验 取冻干地黄样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、4、8、16、24、48 h 进样测定，记录高效液相色谱图，通过相似度评价软件计算相似度，结果均大于0.99，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取冻干地黄和生地黄样品，按“2.2.2”项下方法分别平行制备供试品溶液6 份，在“2.1”项色谱条件下，记录高效液相色谱图，通过相似度评价软件计算相似度，结果冻干地黄和生地黄相似度均大于0.98，表明该方法重复性良好。

2.4.4 耐用性试验 对不同色谱柱Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xterra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Aichrom Bond-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和不同色谱仪Waters（515 泵、2996 检测器，2695 泵、2998 检测器，Empower 工作站）及Agilent Technologies1200 series 分别进行了考察，结果不同的色谱柱和色谱仪重复性良好。且柱温对精密度、重复性和稳定性等影响较大，经考察柱温以30 ℃为宜。

2.5 指纹图谱建立 分别取10 批冻干地黄和生地黄样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，记录高效液相色谱图，确定了8 个共有峰，见图1；运用中国药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2010A 版”对所得指纹图谱进行分析，见图2～3。

图1 冻干地黄样品各成分HPLC 色谱图

图2 10 批冻干地黄HPLC 指纹图谱

图3 10 批生地黄HPLC 指纹图谱

2.6 相似度分析 对10 批冻干地黄和生地黄的的指纹图谱分别进行相似度评价，结果见表2～3；对10 批冻干地黄和生地黄共同进行相似度评价，结果见表4。

2.7 聚类分析 运用SPSS 20.0 软件对10 批冻干地黄指纹图谱进行系统聚类分析，采用组间联接法，利用欧氏距离平方作为样品的测度，结果见图4。10 批冻干地黄样品聚类分为2 大类，山西运城地区的永济、临猗、万荣及侯马聚为1 类，山西临汾地区洪洞、襄汾、浮山及河南焦作聚为2 类，表现出明显的地域特征。山西临汾产地黄与河南产地黄相似度极高，佐证了李卫民等［10］对地黄道地药材变迁的思考。

表2 10 批冻干地黄样品相似度

表3 10 批生地黄样品相似度

表4 10 批生地黄、冻干地黄样品相似度

图4 10 批冻干地黄样品聚类树状图

3 讨论

实验结果显示，冻干地黄、生地黄的指纹图谱相似度均大于0.9，相似度良好；而将10 批冻干地黄和生地黄共同进行评价，相似度在0.611～0.749 之间，表明冻干地黄和生地黄质量存在明显差异，本实验所建立的指纹图谱能有效区分冻干地黄和生地黄。冻干地黄和生地黄指纹图谱的主要差异在于化学成分含有量的不同（冻干地黄多数共有峰面积明显大于生地黄），此与本课题组前期报道的结果一致［3］，表明冻干地黄比生地黄能够有效保留活性成分。

实验参考相关文献［1，11-17］，针对地黄主要活性成分地黄苷A、地黄苷D、梓醇、毛蕊花糖苷等极性较大的特点，对提取溶剂（水、甲醇、乙醇）、提取方法（冷浸、回流、超声、冷浸+回流或超声）、提取时间（0.5、1、1.5 h，冷浸均为12 h）、流动相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-不同浓度磷酸溶液）和供试品溶液制备的定容溶剂（1∶99的乙腈-0.02% 磷酸、不同浓度甲醇）等进行考察，确定了“2.1”项下条件。另外，在冻干地黄、生地黄HPLC 指纹图谱中，保留时间95～120 min 也出现一些稳定色谱峰，经考察为溶剂造成，故选取95 min 之前的色谱图进行指纹图谱评价。