异甘草素对氧糖剥夺/复糖复氧损伤SH-SY5Y 细胞的保护作用

原增艳，宋小锋，张 婷

（新乡医学院三全学院，河南 新乡 453000）

脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）是缺血性脑卒中的主要病理机制，氧化应激在CIR 过程中起重要作用，CIR 发生时活性氧（ROS）生成显著增加［1］。在CIR 过程中，脑细胞处于缺氧-葡萄糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）状态，这可能对脑细胞造成不可逆的损伤［2-4］。

Nrf2-ARE 通路是重要的内源性抗氧化应激通路之一。核因子红血球相关因子2（Nuclear factor erythroid -related factor 2，Nrf2）是氧化应激的抑制剂。在非应激条件下，Nrf2 存在于细胞质中，与胞质伴侣蛋白（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）的结合后被转移到泛素-蛋白酶体系统进行降解［5］。然而，被激活后，Nrf2 转位到细胞核，与ARE 启动子部位结合，启动Nrf2 下游靶基因，增加下游细胞保护蛋白的表达，如血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）和奎宁氧化还原酶1（quinine oxidoreductase 1，NQO-1）增强细胞对氧化应激的对抗作用［6］。研究表明，Nrf2/ARE 通路激活可抑制活性氧的聚集，并减轻OGD/R所致的神经细胞损伤［7］。

查尔酮化合物被认为是具有潜在药理活性的黄酮类化合物，异甘草素作为一种查尔酮化合物存在于串果藤、甘草、降香中。研究发现，异甘草素能通过激活SIRT1，降低实验性糖尿病神经病变大鼠的的氧化损伤［8］，并且可降低NF-κB 活性发挥对脓毒症小鼠脑损伤的保护作用［9］。另有研究表明，异甘草素可通过抑制氧化应激降低缺血再灌注所致的损伤［10］。同时，异甘草素可通过抑制氧化应激和调控Nrf2/HO-1 通路减轻小鼠急性胰腺炎的症状［11］。然而，很少有研究探讨异甘草素在CIR 中的抗氧化应激作用。并且，目前尚不清楚异甘草素是否通过调节Nrf2/ARE 信号通路在CIR 下发挥保护神经功能的作用。本研究旨在探讨异甘草素对CIR 诱导的氧化应激损伤的保护作用及这些保护作用的潜在机制。

1 材料

1.1 细胞株 人骨髓神经母细胞瘤细胞株（human neuroblastoma cell，SH-SY5Y 细胞）购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 药物与试剂 异甘草素购自成都瑞芬思生物科技有限公司（纯度＞98%，批号171106）；MTT 购自美国国Sigma公司（货号M5655）；GSH、SOD、MDA 活性检测试剂盒（批号分别为20170521，20170712，20170608）购自南京建成生物技术研究所；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（批号170723）、caspase-3 活性检测试剂盒（批号；170812）、caspase-9 活性检测试剂盒（批号170612）、活性氧检测试剂盒（批号170824）均购自碧云天生物技术研究所；TRIzol（总RNA 抽提试剂，货号15596018）购自美国赛默飞世尔科技公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒（货号RR047 A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）荧光定量试剂盒（货号RR820 A）购自宝生物工程（大连）有限公司；HO-1 抗体购自英国Abcam 公司。

1.3 仪器 LightCycler 96 Real-Time PCR System 购自瑞士罗氏公司；Multiskun Mk3 酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

2 方法

2.1 Nrf2-siRNA 转染SH-SY5Y 细胞 通过检测5～100 nmol/L 的转染效率，筛选出细胞毒性最小的转染效果。沉默Nrf2 基因序列Nrf2-siRNA（Si Nrf2-sense RNA，5′-GGAUUAUUAUGACUGUUAAAU-3′；Si Nrf2-antisense RNA，5′-UUAACAGUCAUAAUAAUCCUU-3′）。细胞提前一天铺板，转染时细胞密度为30%～50%，将Nrf2-siRNA 溶于Opti-mem 无血清培养基中，混匀，放置5 min，同时将lipo2000 溶于Opti-mem 无血清培养基中，二者混合，放置20 min，将上述混合液加入培养孔，混匀，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h 后，去除上清，加入含10% 胎牛血清的完全培养基培养48 h，通过PCR 检测合格后，备用。同样方法转染阴性对照NC Nrf2-siRNA。

2.2 OGD/R 模型及细胞分组 用Earle′s 平衡盐溶液代替含葡萄糖的完全培养基，将细胞置于低氧条件下（含5%CO2、0.5% O2和94.5% N2）培养2 h，换为含葡萄糖的完全培养基，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h。分为正常组、模型组、异甘草素组、Nrf2-siRNA 组、NC Nrf2-siRNA 组。正常组，SH-SY5Y 细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基正常培养。模型组，正常培养SHSY5Y 细胞进行OGD/R，继续培养48 h。异甘草素组在OGD 前2 h 给予终浓度20 μmol/L 异甘草素，OGD/ R 后24 h换液，同样换成含终浓度20 μmol/L 异甘草素的完全培养基继续作用24 h。siRNA-Nrf2 组，使用经siRNA-Nrf2转染后的SH-SY5Y 细胞，其它处理同异甘草素组。NC Nrf2-siRNA 组，使用转染阴性对照NC Nrf2-siRNA 后的SHSY5Y 细胞，其它处理同异甘草素组。

2.3 MTT 检测细胞活力 细胞接种于96 孔培养板，每孔加入0.1 mL 培养基，各组细胞进行相应处理后，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，37 ℃孵育4 h。吸去孔内培养液，每孔加入DMSO 150 μL，摇床低速震荡10 min，使结晶充分溶解，然后应用酶标仪在490 nm 波段检测吸光度值（OD）。

2.4 LDH 检测 LDH 的检测应用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，严格按说明书操作。各组细胞进行相应处理后，将细胞培养板用多孔板离心机，400g离心5 min。分别取各孔的上清液120 μL，加入到新的96 孔板相应孔中，随后各孔分别加入60 μL LDH 检测工作液。混匀，室温，用铝箔包裹后置于水平摇床避光孵育30 min。然后在490 nm 处测定OD。以正常组作为参照，将正常组的吸光度值作为100%，以测得OD实验组/OD正常组分别表示各组相对LDH水平。

2.5 caspase-3、caspase9 活性检测 分别应用caspase-3、caspase9 活性检测试剂盒。各组细胞进行相应处理后，裂解液裂解细胞，于4 ℃下，16 000g离心12 min。取上清，使用Bradford 法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为1.5 mg/mL。取待测样品50 μL，加入检测缓冲液40 μL，适当混匀，随后caspase-3 检测加入caspase-3 显色底物Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L）10 μL，caspase-9 检测加入caspase-9 显色底物Ac-LEHD-pNA（2 mmol/L）10 μL，再次混匀。37 ℃孵育100 min，测定405 nm 处OD。以测得OD实验组/OD正常组分别表示各组相对caspase-3、caspase9 活性。

2.6 细胞内ROS 检测 用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针测定ROS 水平。使用活性氧检测试剂盒，严格按说明书要求操作。按照1∶1 000 用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA 中，细胞浓度为1×107/mL，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min 颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透细胞膜，细胞内的ROS 可以氧化无荧光的DCFH 生成有荧光的DCF。荧光分光光度计检测DCF 的荧光就反映细胞内ROS 水平。以正常组作为参照，将正常组荧光强度作为100%，以测得的实验组荧光强度/正常组荧光强度表示各组相对ROS 活性。

2.7 细胞内MDA、SOD、GSH 活性检测 6 孔板培养SHSY5Y 细胞，各组细胞进行相应处理后，收集细胞，于4 ℃下PBS 洗涤2 次。沉淀细胞用细胞裂解液裂解，4 ℃离心取上清作为待测样品。然后严格按试剂盒说明操作，加相应试剂反应显色，最后用722 型分光光度计在相应波长处测定吸光度值。

2.8 RT-PCR 检测Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表达 采用TRIzol 法提取细胞内总RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA。然后以转录后的cDNA 为模板，管家基因β-actin 为内参，使用GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR 扩增。反应体系为TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA 2 μL，无菌去离子水6.4 μL，总体积20 μL。引物序列，NQO1 正向5′-TGAGTCTCTGGACCCCTCTAC-3′，反向5′-CTGCCTGGACAAAGACCGAG-3′；HO-1 正向 5′-GGAACTGAGGATGCTGAAGG-3′，反向5′-AAGGAGGAAGGAGCCTATGG-3′；Bcl-2正向 5′-GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，反向 5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；Bax正向5′-CATATAACCCCGTCAACGCAG-3′，反向5′-GCAGCCGCCACAAACATAC-3′；βactin正向 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，反向 5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。反应条件，95 ℃预变性30 s；变性95 ℃5 s，退火延伸60 ℃20 s，重复40 个循环。实验重复3 次。各mRNA 相对表达量用2-ΔΔCt表示。

2.9 Western blot 检测HO-1 蛋白表达 细胞裂解液冰上裂解细胞，于4 ℃下，12 000 r/min 离心5 min，取上清。使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，沸水浴加热5 min，充分变性蛋白，冷却到室温后，蛋白样品加入SDSPAGE 胶加样孔内，100 V、90 min 电泳。使用PVDF 膜，转膜，随后5% 脱脂奶粉室温封闭1 h。加入HO-1 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜3 次后加入二抗室温摇床孵育1 h。特超敏ECL 化学发光试剂盒显影，以HO-1 与β-Actin 条带灰度的比值表示HO-1 的相对表达。

2.10 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据以（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 异甘草素对细胞活力的影响 由表1 可见，与正常组相比，模型组细胞活力下降（P＜0.01），异甘草素组能提高OGD/R 细胞的活力（P＜0.01）。与NC Nrf2-siRNA 组相比，敲低Nrf2 能抑制异甘草素对OGD/R 细胞活力的促进作用（P＜0.01），。各组细胞镜下状态见图1。

图1 各组细胞显微镜镜下状态（×100）

3.2 异甘草素对培养液中LDH 水平及caspase-3、caspase-9活性的影响 与正常组相比，模型组LDH 水平和caspase-3、caspase-9 活性升高（P＜0.01）；与模型组比较，异甘草素组LDH 水平和caspase-3、caspase-9 活性降低（P＜0.01）。而与NC Nrf2-siRNA 组相比，敲除Nrf2 能逆转异甘草素对OGD/R 细胞LDH、caspase-3、caspase-9 的作用（P＜0.01）。见表1。

表1 异甘草素对细胞活力、LDH 水平及caspase-3、caspase-9 活性的影响（，n=3）

表1 异甘草素对细胞活力、LDH 水平及caspase-3、caspase-9 活性的影响（，n=3）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与NC Nrf2-siRNA 组比较，△△P＜0.01。

3.3 异甘草素对细胞内ROS 的影响 与正常组相比，模型组细胞内ROS 水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，异甘草素组能降低ROS 水平（P＜0.01）。与NC Nrf2-siRNA组相比，敲低Nrf2 抑制了异甘草素对OGD/R 细胞ROS 水平的降低作用（P＜0.01）。见表2。

3.4 异甘草素对细胞内MDA、SOD、GSH 水平的影响 与正常组相比，模型组细胞内MDA 水平升高（P＜0.01），而SOD、GSH 水平下降（P＜0.01）。与模型组比较，异甘草素组能增加SOD、GSH 水平，降低MDA 水平（P＜0.01）。与NC Nrf2-siRNA 组相比，敲低Nrf2 基因能逆转异甘草素对OGD/R 细胞中SOD、GSH、MDA 的作用（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 异甘草素对细胞内ROS、GSH、SOD、MDA 水平的影响（，n=3）

表2 异甘草素对细胞内ROS、GSH、SOD、MDA 水平的影响（，n=3）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与NC Nrf2-siRNA 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.5 异甘草素对Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 的表达 与正常组相比，模型组BaxmRNA 表达升高（P＜0.01），而Bcl-2、NQO1、HO-1 mRNA 表达下降（P＜0.01）。与模型组比较，异甘草素组能增加Bcl-2、NQO1、HO-1 mRNA 表达，降低BaxmRNA 表达（P＜0.01）。与NC Nrf2-siRNA 组相比，敲低Nrf2 能逆转异甘草素对OGD/R细胞 中Bcl-2、NQO1、HO-1、Bax mRNA 表达作用。见表3。

表3 异甘草素对Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表达的影响（，n=3）

表3 异甘草素对Bcl-2、Bax、NQO1、HO-1 mRNA 表达的影响（，n=3）

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与NC Nrf2-siRNA 组比较，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

3.6 异甘草素对HO-1 蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组HO-1 蛋白表达下降（P＜0.01）。与模型组比较，异甘草素组能增加HO-1 蛋白表达（P＜0.01）。与NC Nrf2-siRNA 组相比，敲低Nrf2 基因抑制了异甘草素对OGD/R细胞HO-1 蛋白的促进作用。见图2。

图2 异甘草素对HO-1 蛋白表达的影响（n=3）

4 讨论

SH-SY5Y 细胞系（人骨髓神经母细胞瘤细胞株），来源于人神经母细胞瘤，细胞分化程度低，其形态（呈锥体状并且有明显的轴突）、生理生化特性与正常神经细胞类似，并且活性好，成活率高，培养体系稳定，所以常用于神经系统疾病发病机制和相关治疗药物作用效果及机制方面的研究［12-13］。

中风是造成成年人死亡和后天残疾的主要原因［14］。在所有卒中病例中，缺血性中风占60%～70%［15］。一般来说，大脑比其他任何器官都更容易发生缺血。脑缺血阻断氧气输送和营养，恢复血液供应（再灌注）仍然是缺血的标准治疗。然而，再灌注本身也会引起迟发性继发性脑损伤［16］。由ROS 过度生成引起的过度氧化应激在脑缺血再灌注损伤的发病机制中起着关键作用［17］。Nrf2-ARE 通路是重要的内源性抗氧化应激通路之一。Nrf2 及其靶基因的激活可保护大脑免受缺血再灌注损伤［18］。HO-1、NQO1 是Nrf2 下游的一种高度可诱导的抗氧化还原酶，主要受Nrf2-ARE 通路调节。Nrf2 通过激活包括HO-1、NQO1 在内的下游抗氧化蛋白来调节氧化应激的主要转录因子［19］。Nrf2 作为氧化还原敏感转录因子，在氧化应激刺激下会启动Ⅱ相解毒酶（SOD、CAT、GSH-Px 等）和抗 氧化酶的基因（HO-1、NQO1 等）的表达，进而保护组织免受氧化应激损伤［20-21］。在本研究中，我们发现异甘草素能显著减轻氧化应激，而Nrf2 基因敲除显著抑制了异甘草素在OGD/R 处理神经元中的有益作用，表明异甘草素可能诱导Nrf2/ARE活化，从而减轻OGD/R 所致的氧化应激反应。

另外现在普遍认为，细胞凋亡是导致脑缺血再灌注损伤神经元死亡的主要原因［20］。因此，抑制细胞凋亡可能是一种有效的治疗脑缺血再灌注损伤的方法。凋亡是由多种凋亡相关蛋白调控的，包括Bcl-2 蛋白家族和caspase 级联［22］。Bcl-2 家族蛋白在调节细胞凋亡中起关键作用，并且与许多疾病的发展有关［23］。Bcl-2 家族蛋白是众所周知的调节线粒体外膜通透性的调节因子，它与线粒体凋亡信号通路的激活有关［24］。触发线粒体外膜通透性的阈值是由Bcl-2 家族的三个亚组之间的相互作用控制的：促凋亡蛋白（BAK 和Bax），抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡的BH3蛋白［25］。线粒体通透性增高会释放细胞色素c，caspase-9可以和细胞色素c 以及Apaf1 形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9 可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase-3，从而促进后续的细胞凋亡信号。在本研究中，我们发现模型组Bax 表达增加，Bcl-2 表达减少，同时caspase-3，9 的活性增高，提示OGD 诱导神经细胞凋亡由线粒体凋亡信号传导。而异甘草素可抑制该信号通路的激活。研究显示异甘草素显著增加了Bcl-2 mRNA 表达并降低Bax mRNA 的表达，进而阻止caspase-3，9 的激活，这些均表明异甘草素在缺血再灌注损伤中，具有潜在的抗凋亡作用。而Nrf2 基因敲除可抑制这种作用，提示异甘草素的抗凋亡作用是通过与氧化应激反应相关的途径介导的。异甘草素抗氧化应激，保持线粒体膜电位，阻止凋亡信号通路的激活。

综上所述，研究结果表明，OGD/R 诱导神经细胞的氧化应激和凋亡。异甘草素通过激活Nrf2/ARE 信号通路降低神经细胞的氧化应激和凋亡。本研究揭示了OGD/R 后异甘草素神经细胞保护作用的新机制，提示异甘草素可能是缺血性脑中风的潜在治疗药物。