基于色度原理分析安息香颜色与化学成分的相关性

谢 巧，廖 莉，栗圣榕，郭晓庆，王 建，车 静，夏厚林

（成都中医药大学，四川 成都 611137）

颜色是药材经验鉴别、质量评价的常用指标，然而人眼对颜色的判定往往受主观因素的影响，缺乏客观、可量化的标准［1］。近年来，分光测色仪逐渐应用到中药颜色测定中［2］，可快速测定药材粉末、提取液的色度值，但不适用于中药材、中药饮片等形态非均匀性样品的颜色测定［3］。颜色特征参数一定程度上弥补了测色仪的局限性，其通过计算机图像处理技术对图像分析加工，从而将药材颜色客观量化［4-5］。此外，研究表明，药材颜色与化学成分含有量密切相关，如防风［2］、龙胆［3］、西红花［6］、大黄［7］等药材的颜色与内在成分含有量具有显著相关性。

安息香具有开窍醒神、行气活血、止痛的功效，常用于治疗中风痰厥、气郁暴厥、中恶昏迷、产后血晕等症［8］。现代药理研究表明其具有脑保护［9］、抗炎解热［10-11］以及促进雌激素合成［12］等作用。安息香主要含有香脂酸类、木脂素类、三萜类等成分。香脂酸类是安息香发挥芳香开窍作用的活性成分［13］，主要为苯甲酸及其酯类，苯甲酸为香脂酸类的代表成分，2015 版《中国药典》将其作为安息香的定性鉴别和含有量测定指标。苯甲酸松柏酯为安息香中重要的香脂酸类成分，含有量为3.30%～66.75%［14］，具有促进血脑屏障通透性、开窍醒神、抗内毒素等作用，是安息香的药效活性成分［13，15］。

安息香表面、断面颜色是评价其品质最直观的指标，在经验鉴别中常称为“断面白”。本研究引入现代色度原理，用颜色特征参数L、a、b 值表征安息香的表面颜色，采用分光测色仪测定安息香断面粉末的L*、a*、b*值，用HPLC 法测定苯甲酸、苯甲酸松柏酯的含有量，探讨安息香表面、断面的色度值和苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量的相关性，以期为安息香的质量控制及质量评价提供依据。

1 材料

1.1 药材 18 批安息香样品均购自成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学药用植物教研室卢先明教授鉴定S1～S16 为安息香科植物Styrax tonkinensis（Pierre）Craib ex Hart 的干燥树脂（药典品种，商品名为泰国安息香），S17～S18 为安息香科植物Styrax ChineseHu et S.Y.Liang 的干燥树脂（中华安息香）。

1.2 试剂与药物 甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；甲酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；其余试剂均为分析纯。

苯甲酸松柏酯对照品（实验室自制，纯度＞98%）；苯甲酸对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB180305，纯度＞98%）。

1.3 仪器 Agilent1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ-600DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XP205 电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市宇翔仪器有限公司）；CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司）；ZEISS 全自动立体显微镜SteREO Discovery.V12（德国卡尔蔡司公司）。

2 方法与结果

2.1 传统性状观察 在日光下以肉眼观察18 批安息香表面及断面颜色，结果见表1。18 批样品表面多为黄棕色，断面呈象牙白，与2015 年版《中国药典》一部对安息香的性状描述相符，部分样品表面呈棕黑色，断面有黄心。

2.2 表面色度值测定 采用全自动立体显微镜采集安息香药材的表面图像。将安息香样品放在固定圆形平台上，将LED 冷光源颜色调整为6 000k（正白），Light 值为42，采用ZEN 2 pro 软件多维采集安息香样品图像，保存为jpg 格式，使用Photoshop 软件处理图像，从各个颜色的直方图中采集安息香表面的颜色特征参数L、a、b 值。每份样品随机采集3 次，记录各参数的平均值，结果见表1。

2.3 断面色度值测定

2.3.1 样品前处理 将安息香刮去氧化表面，粉碎，过3 号筛，混匀，供安息香断面色度值测定。

2.3.2 测定方法 取样品断面粉末约2 g，均匀平铺在测色皿底部，测定条件为光源D65、视场10°、视角孔径30 mm、起止波长360～740 nm、模式SCE（排除镜面反射），仪器黑白板校正后测定。重复测定3 次，记录L*、a*、b*平均值。

2.3.3 重复性试验 取样品S1 的断面粉末，依法测定，平行测定6 份。L*、a*、b*值的RSD 分别为0.12%、0.48%、0.18%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取样品S1 的断面粉末，依法于0、1、2、3、4、5、6 h 测定。L*、a*、b*值RSD 分别为0.17%、0.47%、0.26%，表明样品在6 h 内稳定性良好。

2.3.5 样品测定 依法测定18 批样品断面粉末的L*、a*、b*值。结果见表1。

2.4 含有量测定

2.4.1 苯甲酸 参照2015 年版《中国药典》一部安息香项下苯甲酸含有量测定方法测定18 批样品中苯甲酸的含有量，结果见表1。

2.4.2 苯甲酸松柏酯 参照课题组建立的苯甲酸松柏酯含有量测定方法进行实验［14］。

2.4.2.1 色谱条件 InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水-甲酸；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长268 nm；进样量20 μL。

2.4.2.2 供试品溶液制备 取安息香药材，粉碎，过3 号筛，取粉末0.1 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，超声提取30 min，放冷，补足减失质量，滤过，弃去初滤液，取续滤液1 mL 定容至50 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.2.3 对照品溶液制备 精密称定苯甲酸松柏酯对照品5.16 mg，置于5 mL 棕色量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制得质量浓度为1.032 mg/mL对照品贮备液。

2.4.2.4 线性关系考察 取苯甲酸松柏酯对照品贮备液，稀释成质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、500 μg/mL 的对照品溶液，在“2.4.2.1”项条件下测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行回归得方程Y＝67.581X+134.91（r＝1.000 0），表明苯甲酸松柏酯在3.98～499.45 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.4.2.5 样品含有量测定 精密吸取各供试品溶液20 μL，在“2.4.2.1”项条件下测定峰面积，平行测定3 次。18 批样品苯甲酸松柏酯含有量测定结果见表1。

表1 安息香色度值及各成分含有量（n=3）Tab.1 Benzoin color value and content determination of various constituents（n=3）

2.5 相关性分析 采用SPSS 22.0 软件对色度值和苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量进行正态性检验，均符合正态分布，故采用Pearson 相关性分析，结果见表2。

表2 色度值与各成分含有量的相关性分析Tab.2 Correlation analysis between chromaticity value and content determination of various constituents

2.6 成分含有量-色度值回归方程建立 以色度值为自变量，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量为因变量，采用SPSS 22.0 软件进行回归分析，建立成分含有量-色度值的回归方程，结果见表3～5。

3 分析与讨论

颜色特征参数Lab 模式与测色仪L*a*b*模式均是在国际照明委员会（CIE）制定的颜色度量国际标准基础上建立的（L 为亮度，a 为红-绿色轴，b 为黄-蓝色轴）［3］，2 种方法均可快速将药材颜色客观量化，具有一定实用性。安息香表面颜色较均匀，采用样品表面图片提取颜色特征参数Lab 来体现安息香表面整体特征，重现性良好。由于部分安息香样品断面呈现不均匀黄心，在预实验中多次测定断面的颜色特征参数结果差异较大，不能准确反映安息香的断面颜色，因此将安息香刮去氧化表面、粉碎并混匀，用测色仪测定安息香断面色度值L*a*b*可兼顾安息香断面和内部颜色，经系统适应性考察该方法可行。

表3 各成分含有量-色度值回归分析结果Tab.3 Results of content determination of various consti tuents-chromaticity value regression coefficient

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

表5 各成分含有量与色度值线性关系Tab.5 Linear relationships of various constituents and chromaticity value

传统经验鉴别认为安息香以“表面黄棕色、断面象牙白”为优［16］，本研究结果显示，当安息香表面为黄白色至黄棕色、断面为象牙白时，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量较高；当表面为棕黑色、断面多黄心时，苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量低，质量较差。结合外观性状及色度值可知，安息香表面、断面颜色与苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量具有一定相关性。本研究收集的中华安息香批次较少，未能充分阐明泰国安息香与中华安息香的区别，还需加大样本量为不同品种安息香的定性鉴别提供依据。

由相关性分析可知，苯甲酸含有量与安息香表面a 值呈正相关，与表面L、b 值无相关性；苯甲酸含有量与安息香断面L*值呈正相关，与断面a*、b*值无相关性，即表面a 值、断面L*值越大，苯甲酸含有量越高。苯甲酸松柏酯含有量与安息香表面L 值呈正相关，与表面a、b 值无相关性；苯甲酸松柏酯含有量与安息香断面L*值呈正相关，与b*值呈负相关，与a*值无相关性，即表面L值、断面L*值越大，断面b*值越小，苯甲酸松柏酯含有量越高。由回归分析可知，安息香表面、断面颜色受苯甲酸松柏酯含有量的影响大于苯甲酸。由方差分析结果可知，本研究建立的成分含有量-色度值的-回归方程具有统计学意义，可通过安息香表面、断面色度值快速预测苯甲酸、苯甲酸松柏酯含有量。

本研究可为安息香“表面黄棕色，断面象牙白”的经验鉴别提供依据，以期为安息香药材的质量评价与质量控制提供参考，但其有效性还需在今后工作中加大样本量进一步研究。