PEG修饰Fe3O4纳米粒子（MNPs）的制备及载药研究

辛亮亮，舒玥，刘欢，胡雅稳，杨琳燕,通信作者

PEG修饰Fe3O4纳米粒子（MNPs）的制备及载药研究

辛亮亮1，舒玥2，刘欢2，胡雅稳2，杨琳燕2,通信作者

（1. 天津药明康德新药开发有限公司 国内新药研发服务部，天津 300457；2. 天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384）

盐酸阿霉素（DOX）是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成发挥作用，其抗瘤谱较广，对于多种肿瘤细胞均有杀灭作用。本研究首先通过共沉淀合成法制备Fe3O4纳米粒子（MNPs），再依法制备Fe3O4@SiO2以及Fe3O4@SiO2－NH2纳米粒子，然后对Fe3O4@SiO2－NH2样品进行单端羧基PEG和双端羧基PEG的修饰，得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品，利用PEG修饰产物装载不同质量的盐酸阿霉素（DOX），得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX。荧光分光光度计检测结果表明，PEG修饰的Fe3O4纳米粒子（MNPs）载入不同质量的DOX除增加阿霉素的磁靶向性能外，因PEG的引入，生物相容性也得到增强。

Fe3O4；PEG修饰；DOX；载药

Fe3O4纳米粒子作为典型的磁性功能材料，已被广泛运用在各个方面，常用作磁记录材料[1]、颜料[2]、催化剂[3]、磁流体材料[4]、磁性高分子微球、电子材料等，是最常见的磁性纳米材料之一，在磁记录、颜料、磁流体、医药、催化、电子、生物医学等领域具有广阔的应用前景。目前，制备Fe3O4纳米粒子的传统方法是共沉淀法[5]，但因 Fe2＋极易被空气氧化，为得到纯Fe3O4，在制备过程中需要严格控制溶液的pH值，同时为了使Fe2＋和Fe3＋按化学计量比反应，需用惰性气体保护反应体系[6-10]，因此该方法的工艺比较复杂。但与水热法相比，该方法所制备的纳米粒子粒度更小，耗时更短。

盐酸阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来发挥药理作用，本品抗瘤谱较广，对多种肿瘤细胞均有杀灭作用。对乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、胃癌、肝癌等均有一定疗效，在阿霉素的诸多测定方法中，荧光分析法是测定DOX含量的有效分析方法。

本研究中采用FeCl2、FeCl3和NaOH在氮气的保护作用下，水浴加热同时磁力搅拌产生Fe3O4，后用原硅酸四乙酯（TEOS）对其表面进行包覆，得到Fe3O4@SiO2样品，再用3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）对其表面进行修饰，得到Fe3O4@SiO2－ NH2样品，后经双端羧基PEG和单羧基PEG修饰，分别得到Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH和Fe3O4@ SiO2－NH2－PEG MNPs。将所得修饰产物进一步用于阿霉素的装载，以增强其磁靶向性和生物相容性。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

所用试剂：无水乙醇（天津市康科德科技有限公司）；原硅酸四乙酯（TEOS）、3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、盐酸阿霉素（DOX）（上海源叶生物有限公司）；双羧基聚乙二醇（CM－PEG－CM，Mw2000）、单羧基聚乙二醇（CM－PEG，Mw5000）（上海金畔生物技术有限公司）。

所用仪器：超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-100D）；水浴恒温摇床（上海达平仪器有限公司，SKY-110WX）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；磁力搅拌器（北京中兴伟业仪器有限公司）；荧光分光光度计（美国VARIAN公司 Cary Eclipse）。

1.2 Fe3O4的制备

向规格为100 mL的三颈瓶中加入7.5 mL 0.2 mol/L FeCl3溶液和7.5 mL 0.12 mol/L FeCl2溶液，混合均匀，使整个反应环境处于氮气的保护下，加热至55 ℃，磁力搅拌持续15 min，迅速加入7.2 mL 3 mol/L NaOH溶液，同时用磁力快速搅拌，反应40 min后，形成的黑色流体再持续加热至90 ℃。再经过30 min后，冷却至室温，将产物放入50 mL塑料离心管中，置于强力磁铁上，进行磁铁吸附使其沉淀，将上清液吸出丢弃，用去离子水多次洗涤沉淀物使其pH呈中性，将上清液再次吸出丢弃，然后放置于真空干燥箱中烘干。

1.3 Fe3O4@SiO2的制备

称取10份干燥的Fe3O4样品，每份10 mg，依次放入50 mL塑料离心管中，每管中加入2 mL 0.1 mol/L稀盐酸，超声震动20 min使其充分混合后置于磁铁上，磁铁吸附沉淀，将上清液吸出丢弃，然后用去离子水洗涤沉淀物。再将20 mL无水乙醇、5 mL去离子水，0.25 mL NH3·H2O依次加入沉淀物中，超声震荡20 min，使其充分混合均匀，然后分别向每管中加入32 μL原硅酸四乙酯（TEOS），放入摇床中，转速140 r/min，室温震荡6 h。取出后置于磁铁上，吸附沉淀，将上清液吸出丢弃，用无水乙醇将沉淀物洗涤，获得Fe3O4@SiO2。

1.4 Fe3O4@SiO2－NH2的制备

磁铁吸附沉淀，弃去上述样品中的无水乙醇溶液，向每管样品中分别加入4 mL无水乙醇，之后再加入50 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS），30 min超声震荡，使其充分混合均匀，然后放入摇床，转速设置为140 r/min，室温震荡24 h，得到样品Fe3O4@SiO2－NH2后用磁铁进行吸附，使其沉淀，将上清液吸出丢弃，随后用无水乙醇将沉淀物洗涤，进行真空干燥。

1.5 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的制备

将单羧基聚乙二醇（CM－PEG，0.5 g，0.1 mmoL）溶于2.5 mL 2-吗啉乙磺酸（MES，0.1moL/L，pH6）中，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，0.019 2 g，0.1 mmoL）超声30 min，后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，0.011 5 g，0.1 mmoL）超声30 min，放在摇床中，转速为140 r/min，经过12 h让其活化。使Fe3O4@SiO2－NH2沉浸在上述溶液中，每管20 mg，超声波震荡30 min使其充分混合后，放入摇床中，转速140 r/min，过夜反应。置于磁铁上，使其吸附沉淀后弃去上清液，使用去离子水洗涤1次，将其置于真空干燥箱中，80 ℃过夜干燥，制得Fe3O4@SiO2－NH2－PEG。

1.6 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的制备

制备过程同1.5所述，仅用双羧基聚乙二醇（CM－PEG－CM，0.2 g，0.1 mmol）代替CM－PEG（0.5 g，0.1 mmol），制得Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG－COOH。

1.7 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG装载DOX研究

取3份20 mg的Fe3O4@SiO2－NH2－PEG，置于3个10 mL离心管中，分别向离心管中加入10、15、20 mg的DOX，同时在每管中加入8 mL乙醇溶液，超声15 min使其充分溶解后，放置摇床震荡，转速140 r/min。摇床震荡过夜后，用磁铁吸附使其沉淀后，吸取上清液，用2 mL无水乙醇洗残渣后定容至10 mL，再将上清液封口保存，残渣置于干燥箱干燥，得到DOX装载产物Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG·DOX。

1.8 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH装载DOX研究

试验过程同1.7，用Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG－COOH代替Fe3O4@SiO2－NH2－PEG样品，所得样品标记为Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX。

1.9 DOX释放行为的研究

由于肿瘤组织偏酸性，故研究偏酸性条件下所制备磁靶向粒子的释放行为[11]。配制pH5.6的PBS缓冲溶液置于37 ℃下，将10 mg Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG－COOH·DOX和10 mg Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG·DOX样品加入8 mL PBS缓冲溶液中，然后置于摇床中，转速140 r/min，分别经过1、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h，每隔一段时间取出3 mL作为检测样品，再分别补进3 mL新鲜的PBS缓冲溶液。取至最后一次时去掉上清液但不再加入PBS缓冲溶液，残渣放入干燥箱干燥。

2 结果与分析

2.1 XPS分析

由表1结合N1s谱可知，399.255eV（－N）和400.247eV（－H2）峰的出现，表明APTMS修饰成功。表1结合C1s谱，288.481 eV峰出现（OO/O－NH），原子含量为4.35%，意味着单羧基聚乙二醇修饰成功。表1结合C1s谱，287.722 eV峰出现（OO/O－NH），原子含量为9.35%，意味双羧基聚乙二醇修饰成功。表1结合N1s谱，401.384 eV峰出现（CO－H），原子百分含量为85.3%，意味着单羧基聚乙二醇修饰成功。表1结合N1s谱，401.108 eV峰出现（CO－H），原子百分含量为55%，同样意味着双羧基聚乙二醇修饰是成功的。因此，Fe3O4@SiO2－NH2、Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH纳米粒子的N1s谱说明APTMS和PEG修饰是成功的[12-15]。

表1 修饰前后材料的结合能和元素比例

图1 XPS扫描全谱：Fe3O4@SiO2－NH2，Fe3O4@SiO2－NH2－PEG，Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH

图2 Fe3O4@SiO2－NH2的C1s谱

图3 Fe3O4@SiO2－NH2的N1s谱

图4 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的C1s谱

图5 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG的N1s谱

图6 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的C1s谱

图7 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的N1s谱

2.2 TGA研究

对Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品进行热重分析，结果见图8。由图8可见，样品190 ℃开始失重，900 ℃尚未降解完全，从残留曲线可知，Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品稳定性优于Fe3O4@SiO2－NH2－PEG样品。

图8 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH的TGA图

2.3 DOX载药量研究

利用荧光分光光度计，激发波长λex＝478 nm，发射波长592 nm，狭缝宽10 nm，进行荧光测定。结果见图9，图10[16,11]。

图9 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG与载入不同质量DOX产生荧光强度的数据曲线图

图10 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH与载入不同质量DOX产生荧光强度的数据曲线图

在纳米粒子浓度影响的研究中，根据图9、图10表明，载入DOX的质量在10～20 mg时均有峰值，样品载入DOX后均产生荧光，整体来看，在样品含量为20 mg时，峰值较好，但荧光强度未呈比例增强，因此后续试验以此浓度为标准，未再增加DOX浓度。

2.4 DOX释放行为的研究

利用荧光分光光度计，激发波长λex＝478 nm，发射波长592 nm，狭缝宽10 nm，进行DOX的荧光测定，结果见图11和图12。

图11 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX释放不同时间后产生荧光强度的折线图

图12 Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX释放不同时间后产生荧光强度的折线图

根据已有文献报道，作为抗癌药的DOX应在癌细胞生长的偏酸性环境释放良好[16]。用pH5.6缓冲液模拟体内偏酸性环境，Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品装载DOX后释放曲线较为平缓。见图12。除去PEG的影响，羧基与DOX中的氨基应存在吸附作用，这可能导致了Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX样品的平缓释放。

3 结论

通过试验表明，氨基化的Fe3O4@SiO2－NH2样品能够进行PEG修饰，所得产物Fe3O4@SiO2－ NH2－PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH经XPS表征，说明单羧基聚乙二醇和双羧基聚乙二醇均可进行氨基化样品修饰。热重分析表明，Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品稳定性优于Fe3O4@SiO2－NH2－PEG样品。Fe3O4@SiO2－NH2－ PEG和Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH样品在乙醇中能够装载DOX。DOX在pH5.6缓冲液中的释放表明，双羧基PEG修饰产物装载DOX样品Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX释放曲线较为平缓，释放效果较好，这可能与MNPs表面的羧基和DOX的氨基之间存在吸附作用有关。

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Preparation and drug loading of PEG modified Fe3O4nanoparticles

XIN Liang-liang1, SHU Yue2, LIU Huan1, HU Ya-wen2, YANG Lin-yan2,Corresponding Author

（1. Domestic Discovery Service Unit, Wuxi App Tec Co., Ltd., Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Doxorubicin hydrochloride（DOX）is an anti-tumor antibiotic that acts by inhibiting the synthesis of nucleic acid in cancer cells. DOX has a broad anti-tumor spectrum and has a killing effect on a variety of tumor cells. In this paper, Fe3O4nanoparticles（MNPs）were prepared by co-precipitation synthesis method, while Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2－NH2nanoparticles were prepared by optimizing experimental conditions. And then single and double carboxyl PEG were applied to modify Fe3O4@SiO2－NH2samples. Fe3O4@SiO2－NH2－PEG and Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH samples could be obtained. PEG modified products were loaded with different quality of DOX. Fe3O4@SiO2－NH2－PEG·DOX and Fe3O4@SiO2－NH2－PEG－COOH·DOX samples could be obtained. After detection by a fluorescence spectrophotometer, a conclusion was drawn. The results showed that PEG－modified Fe3O4nanoparticles（MNPs）loaded with different masses of DOX could increase the magnetic targeting properties of DOX, at the same time, biocompatibility could also be enhanced via the introduction of PEG.

Fe3O4; PEG modification; DOX; drug-loading

1008-5394（2020）03-0043-06

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.010

O656.22

A

2019-07-03

天津农学院杰出科研业绩奖励资助项目（无编号）；国家自然科学基金（31572492，31372482）；省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室资助课题（CMEMR2016-B12）

辛亮亮（1982-），男，副研究员，硕士，主要从事药物合成研究。E-mail：xll_xll@126.com。

杨琳燕（1982-），女，讲师，博士，主要从事纳米药物载体研究。E-mail：y_linyan@163.com。

责任编辑：宗淑萍