HPLC 梯度洗脱法同时测定小儿葫芦散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷含量

2020-10-14翟英英位恒超

药品评价 2020年13期

翟英英，位恒超

1.河南中医药大学第三附属医院药学部，郑州 450008；2.河南中医药大学，郑州 450000

小儿葫芦散是由橘红、天麻、茯苓、天竺黄、葫芦娥等13 味中药材配伍加工而来，现收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第八册［1］，具有化痰消食、镇惊祛风的功效，主要用于痰喘咳嗽、脘腹胀满、胸膈不利、吐乳不食、小儿惊风等病症的治疗［2］。方中橘红为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥外层果皮，具有燥湿化痰、理气宽中的功效，橙皮苷为其主要药效成分；天麻为兰科天麻属植物天麻的干燥块茎，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A等为其主要活性成分，具有抗癫痫、抗惊厥、镇静、镇痛、平肝息风的功效，主要用于对小儿惊风、癲痫抽搐、破伤风等病症的治疗。现代研究表明小儿葫芦散治疗小儿支气管炎［2］、小儿毛细支气管炎［3］、急性支气管炎［4］、小儿喘息性支气管炎［5-7］、婴幼儿肺炎继发腹泻［8］临床疗效确切，可有效改善患儿临床症状，缩短治疗时间，不良反应少。现行质量标准未对所含成分进行定量研究，难以全面评价小儿葫芦散的整体质量。本文采用HPLC 梯度洗脱法，对小儿葫芦散所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷同时进行测定，建立小儿葫芦散多指标成分质量评价方法，为更加全面地评价小儿葫芦散的质量提供参考依据。

1 仪器与试药

Shimadzu LC-10ATvp 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；BS124S 型分析天平（德国Sartorius 公司）。天麻素对照品（批号：110807-201809，含量：96.7%）和橙皮苷对照品（批号：110721-201818，含量：96.2%）均购自中国食品药品检定研究院；巴利森苷E 对照品（批号：PRF16011523，含量：97.1%）和巴利森苷A对照品（批号：14122302，含量：98.4%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯；小儿葫芦散（生产企业：太原大宁堂药业有限公司；批号：190303、190502、190701；批准文号：国药准字Z14 021041；规格：每袋装0.3 g）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备精密称取天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷对照品各适量，用甲醇制成浓度分别为0.152、0.178、0.416、0.934 mg/mL 的4 种对照品贮备液；精密量取上述对照品贮备液各2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成混合对照品溶液（天麻素7.6 μg/mL、巴利森苷E 8.9 μg/mL、巴利森苷A 20.8 μg/mL、橙皮苷46.7 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液和阴性样品溶液的制备取小儿葫芦散内容物适量，研成细粉，取0.5 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流60 min，放冷，用甲醇补重，过滤，制成小儿葫芦散供试品溶液。按小儿葫芦散的处方工艺，分别制备不含橘红、不含天麻的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及专属性试验

采用Agilent Extend C18色谱柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温：25 ℃；流动相：甲醇（A），0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～8.0 min，12.0% A；8.0～26.0 min，12.0%～34.0% A；26.0～38.0 min，34.0%～42.0% A；38.0～45.0 min，42.0%～12.0% A），流速：0.8 mL/min；检测波长分别为220 nm（0～26.0 min 检测天麻素、巴利森苷E 和巴利森苷A）和284 nm（26.0～45.0 min 检测橙皮苷），进样量：10 μL。取“2.1.1”项下混合对照品溶液及“2.1.2”项下各溶液依法进样检测，记录色谱图，结果供试品色谱图中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷色谱峰峰形对称，与相邻色谱峰分离度均＞1.5，理论塔板数按各成分色谱峰计均≥3500，色谱图基线平稳；天麻阴性样品色谱图中未见天麻素、巴利森苷E和巴利森苷A 色谱峰，橘红阴性样品色谱图中未见橙皮苷色谱峰，表明阴性样品对小儿葫芦散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的测定无干扰，色谱图见图1。

2.3 线性关系考察

量取“2.1.1”项下4 种对照品贮备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用甲醇定容至10 mL，制成6 个系列浓度的混合对照品溶液，依法进样检测天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面积，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得各成分线性方程分别为Y天麻素=1.305 7×106X-913.7(r=0.999 3)、Y巴利森苷E=1.531 9×106X+385.2(r=0.999 9)、Y巴利森苷A=1.277 6×106X-1 012.4(r=0.999 5)、Y橙皮苷=9.864 9×105X+717.6(r=0.999 8)，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷分别在1.52～30.40 μg/mL、1.78～35.60 μg/mL、4.16～ 83.20 μg/mL、9.34～186.80 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.4 精密度

取“2.1.1”项下混合对照品溶液连续进样6次，测得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷峰面积的RSD 分别为0.91%、1.27%、0.62%和1.44%。

2.5 重复性

取同一批次小儿葫芦散样品平行制备6 份，依法进样检测天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷峰面积，计算得4 种成分平均含量分别为0.316 mg/g、0.422 mg/g、0.879 mg/g、2.141 mg/g，RSD 分别为1.34%、0.85%、1.21%和0.76%。

2.6 稳定性试验

临用新配一份小儿葫芦散供试品溶液，分别于0、4、8、12、18、24 h 进样检测天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面积，结果小儿葫芦散供试品溶液24 h 内稳定，4 种成分峰面积的RSD 分别为1.59%、0.84%、0.36%和0.87%。

2.7 加样回收率试验

量取根据样品含量另行配制的混合对照品溶液（天麻素0.078 mg/mL、巴利森苷E 0.104 mg/mL、巴利森苷A 0.216 mg/mL、橙皮苷0.532 mg/mL）2.0 mL、4.0 mL 和6.0 mL，分别置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度相当于50%、100%和150%的回收混合对照品溶液，备用；取含量已知的同一批次小儿葫芦散内容物适量，研细，称取9 份，各约0.25 g，分别加入上述回收混合对照品溶液25 mL 各3 份，照“2.1.2”项下方法制成回收供试品溶液，依法进样测定天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面积，计算各成分含量，用测得值与样品原有量之差除以对照品加入量计算回收率，结果天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的平均回收率分别为98.42%、96.93%、99.49%、97.66%，RSD 分别为0.96%、0.67%、1.09%、0.77%。

2.8 样品含量测定

取3 个批次的小儿葫芦散样品，每个批次平行制备3 份供试品溶液，依法进样检测天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面积，采用外标法计算4 个成分的含量，结果见表1。

表1 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

小儿葫芦散由橘红、天麻、茯苓、天竺黄、葫芦娥等13 味中药组方而来，方中药物均细粉直接入药，考虑到所含组分较难提取完全，在供试品溶液制备过程中，首先在加热回流提取60 min 的同一条件下，对比考察不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、95%乙醇、稀乙醇）对小儿葫芦散中待测成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷综合提取率的影响，同时兼顾杂质成分干扰大小等因素，结果以甲醇为提取溶剂时，综合提取效果最佳，杂质对多成分同时测定的干扰较小；遂依次对提取方式和提取时间进行确认（超声提取90 min、加热回流提取90 min、加热回流60 min、加热回流30 min），结果超声提取90 min 待测成分综合提取率明显低于加热回流90 min 所得结果，加热回流60 min 待测成分综合提取率与加热回流90 min 所得结果差异不大，但明显高于加热回流30 min 所得结果，故最终综合考虑采用甲醇加热回流提取60 min 对小儿葫芦散进行处理。

3.2 色谱条件流动相的选择

以小儿葫芦散中待测成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的分离效果为首要指标，同时兼顾分析检测时间、色谱图基线等因素，依次考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液不同流动相体系，结果甲醇-水流动相体系优于乙腈-水体系，但待测成分巴利森苷A 存在拖尾现象；以甲醇-0.1%甲酸溶液流动相体系所得效果最佳，遂对流动相比例进行优化，最终确定按照“2.2”项下梯度洗脱的流动相比例对小儿葫芦散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷含量进行同时测定。