miR-1182在卵巢癌组织中的表达及对肿瘤细胞增殖与转移的影响

李维 张卫平 马静

天津中医药大学第一附属医院检验科300193

0 引 言

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，其早期隐匿性强，不易被发现，导致病死率高。开展卵巢癌的发生、发展及可能机制的研究，对其诊断与治疗有重要意义，已成为妇科恶性肿瘤领域的研究热点[1]。miRNAs（micro RNA）是一类约21 nt的内源性核苷酸小RNA，可作为转录后调节因子的靶向调节靶基因，对机体起调控的作用。miRNAs在肿瘤的生理和病理过程中起重要的调节作用[2]。关于miRNAs相关靶点在卵巢癌转移治疗中的应用研究是近年来的医学研究热点[3-4]。miRNAs在卵巢癌的多药耐药发生过程中，以及在克服卵巢癌化疗药物耐药性过程中起关键的调控作用[5]。miRNAs-1182是miRNAs调控网络的重要组成部分，在胃癌、肠癌、肾癌等恶性肿瘤中，及在细胞增殖、分化、转移等方面起重要的调节作用[6-8]。但是，关于miRNAs在卵巢癌中的研究并不多见。本研究中，分析miRNAs-1182在卵巢癌组织中的表达，探讨其对癌组织增殖与转移的影响，及可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2016～2019年在天津中医药大学第一附属医院就诊的81例卵巢癌患者，年龄范围36～67岁，年龄（51.3±9.8）岁，其中年龄＜50岁患者 46例，年龄≥50岁患者35例。所有患者均经病理确诊为卵巢癌，且均为初治，既往未进行放疗及化疗。

收集患者的卵巢癌组织及对应的癌旁组织，并进行病理分析。肿瘤分期采用2013年国际妇产科联合会的分期标准。81例卵巢癌患者中：Ⅰ期10例、Ⅱ期18例，Ⅲ期32例，IV期21例；高分化11例、中分化22例、低分化48例；上皮性卵巢癌41例、性索间质卵巢癌22例、生殖细胞卵巢癌18例。

另选择同时期在天津中医药大学第一附属医院行卵巢切除术的52例非卵巢癌患者，年龄范围39～66 岁，年龄（53.3±11.4）岁。

1.2 主要材料与仪器

TrizolRNA提取试剂盒、miRNA逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒 SYBR GREEN Premix Ex Taq（日本宝生物工程株式会社）、PCR扩增引物序列[生工生物工程（上海）股份有限公司]，人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）单克隆抗体（美国 ABCAM 公司），β-肌动蛋白（βactin）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（美国Santa Cruz公司），Transwell小室（美国Corning公司）

7900HT Fast实时荧光定量PCR仪（美国ABI Life Technologies公司），Thermo MK3酶标仪、CO2细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)，IX71倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR检测卵巢组织中miR-1182的表达水平

采用Trizol法，按照RNA提取试剂盒说明书提取组织的总RNA，采用miRNAs逆转录试剂盒，以总RNA为模板进行逆转录反应成cDNA。U6引物：5′-GACACGCA-AATTCGTG-3′,5′-GTGCAGGGTCCG-AGGT-3′。miR-1182 引物：5′-ACCTTCCTCAGGACCCTGGTCCGAGGT-3′，5′-CAACATCTACAAGATCCTCCTGCTGCAGG-3′。PCR 反应体系为：cDNA 1.5 μl，miR-1182 或 U6 引 物 1 μl，SYBR GREEN premix Ex taq 10 μl，H2O 7.5 μl。反应条件为：预变性95℃、30 s，变性 95℃、5 s，退火延伸 60℃、30 s，共40个循环；72℃延伸10 min。使用7900HT Fast型实时荧光定量PCR仪，根据2-ΔCt法计算miR-1182的表达量。所有实验均重复3次，取3次结果的均值±标准差为实验结果。

1.3.2 miR-1182病毒转染人卵巢癌细胞株SKOV-3

人卵巢癌细胞株SKOV-3用DMEM培养基（10%胎牛血清）培养，以5×105密度接种于6孔板。正常对照组按照常规培养，病毒转染组采用miR-1182 mimics（1.0 μg/ml）转染细胞，另设立空白病毒组，6 h后换常规培养基。转染48 h后收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，RT-PCR方法见1.3.1节。

1.3.3 Western Blot检测SKOV-3细胞hTERT蛋白的表达情况

转染48 h后收集各组SKOV-3细胞，SDS裂解液提取细胞总蛋白，蛋白定量后每孔蛋白上样量为30 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶500 hTERT单克隆抗体4℃下孵育过夜，1∶1000 二抗室温孵育 1 h，以 1∶1000 的 β-actin作为内参，进行化学发光法显影。

1.3.4 噻唑蓝法检测SKOV-3细胞增殖情况

将SKOV-3细胞以1×104密度接种于96板，按照1.3.2中的分组与病毒转染方法，继续培养24、48、72h后，以每孔加入5mg/ml的噻唑蓝溶液20μl，继续培养4h后弃上清液，每孔加二甲基亚砜150μl，振荡溶解15 min，使用酶标仪检测各孔于450 nm处的吸光度（A450）值。

1.3.5 细胞侵袭实验检测SKOV-3细胞穿膜情况

转染48 h后收集细胞，以1×105密度接种于Transwell小室内，将小室至于含有常规培养基的48孔板内，培养24 h后取出小室，刮去室内细胞，用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，双蒸水清洗，显微镜下选取6个视野进行细胞计数，算平均值。每组设3个复孔。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，两组间数据比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-1182的表达情况

miR-1182在正常卵巢组织、卵巢癌组织和癌旁组织中的表达水平如图1所示。结果显示，miR-1182在正常卵巢组织（3.06±0.29）与癌旁组织（2.92±0.34）中的表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）；miR-1182在卵巢癌组织中的表达水平（0.66±0.19）明显低于正常卵巢组织（3.06±0.29）与癌旁组织（2.92±0.34）（均 P＜0.05）。

图1 miR-1182在组织中的表达水平

2.2 卵巢癌组织中的miR-1182的表达水平与临床病理特征的关系

结果显示，对于卵巢癌组织中miR-1182的表达水平，不同肿瘤分期、组织分化程度患者间的差异有统计学意义（均P＜0.05），而患病年龄与肿瘤类型的差异无统计学意义（均P＞0.05）。（表1）

2.3 卵巢癌细胞miR-1182及hTERT蛋白的表达情况

在SKOV-3卵巢癌细胞转染miR-1182 mimics病毒后，转染组的miR-1182表达水平较空白病毒组和对照组明显升高（均P＜0.05），而对照组和空白病毒组的miR-1182表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。（图 2）

表1 卵巢癌组织中的miR-1182的表达水平与临床病理特征间的关系

图2 各组SKOV-3卵巢癌细胞转染miR-1182 mimics病毒后的miR-1182表达水平

Western Blot结果显示，在SKOV-3卵巢癌细胞转染miR-1182 mimics病毒后，转染组hTERT蛋白表达水平较空白病毒组和对照组明显降低（均P＜0.05），而对照组和空白病毒组的hTERT蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。（图3）

图3 各组SKOV-3卵巢癌细胞转染miR-1182 mimics病毒后的hTERT蛋白表达

2.4 miR-1182对卵巢癌细胞增殖与侵袭的影响

细胞增殖实验结果显示，对照组和空白病毒组在各时间点A450值的差异无统计学意义（均P＞0.05），转染组在培养24、48、72 h后，A450值明显低于对照组和空白病毒组（均P＜0.05）。

细胞培养48 h后，细胞穿膜数量结果显示，对照组和空白病毒组穿膜细胞数的差异无统计学意义（P＞0.05），而转染组穿膜细胞数明显低于对照组和空白病毒组（均 P＜0.05）。（表 2）。

表2 各组SKOV-3卵巢癌细胞转染miR-1182 mimics后细胞的增殖与侵袭情况

3 讨论与结论

miRNAs表达异常发生在很多常见的人类肿瘤组织中。由于miRNAs具有靶向基因的调控作用，对细胞生长、分化和凋亡的调控起重要作用，其与肿瘤的发生、发展密不可分[9-10]。因此，部分miRNAs在肿瘤的诊断与治疗中，存在潜在的应用价值[11-12]。

miRNAs-1182是miRNAs调控网络的重要组成部分。多项研究结果证实，miRNAs-1182对许多肿瘤发挥重要的调节作用[13]。circABCC4通过miR-1182促进FOXP4的表达并促进前列腺癌的恶性发展，circABCC4/miR-1182/FOXP4调节环可能是前列腺癌介入治疗的一个潜在的理想靶点[14]。LINC00339与miR-1182相互作用促进SKA1的表达，表明LINC00339/miR-1182/SKA1在肝癌进展中起重要作用[15]。卵巢癌中高表达circWHSC1，促进了肿瘤的发生，而通过调节miR-145和miR-1182其外显子，作用于腹膜间皮，可诱导肿瘤转移[16]。本研究中，检测了正常卵巢组织、卵巢癌组织和癌旁组织中的miR-1182表达水平，发现miR-1182在卵巢癌组织中表达明显降低，这与Hou等[17]的研究结果一致。此外发现：对于卵巢癌组织中的miR-1182表达水平，不同肿瘤分期、分化程度的患者间有明显差异；随临床分期的进展及组织分化程度增加，miR-1182的表达水平逐渐降低。提示miR-1182可能在卵巢癌的发生发展中起重要作用。

本研究中，通过体外实验进一步研究miR-1182在卵巢癌中的作用机制。在用miR-1182 mimics病毒转染SKOV-3卵巢癌细胞后，检测细胞中miR-1182和hTERT的表达情况。结果显示，转染miR-1182病毒后，miR-1182的表达明显升高，hTERT的表达明显降低。提示在卵巢癌细胞中，miR-1182对hTERT蛋白有负调节作用。有研究结果表明，miR-1182通过与hTERT的开放读码框（open reading frame，ORF）结合，在转录后抑制 hTERT 的表达[4]。有研究者通过荧光素酶检测证实，hTERT是miR-1182的直接靶点，miR-1182在卵巢癌中的抑制作用是通过miR-1182/hTERT轴实现的[17]。

本研究中进一步发现，高表达miR-1182的卵巢癌细胞在培养24、48和72 h后，细胞增殖受到明显的抑制，且高表达miR-1182的卵巢癌细胞的穿膜数量明显减少。该结果提示，miR-1182的表达可明显抑制卵巢癌细胞的侵袭与浸润能力。有研究结果表明，miR-1182的过度表达能显著抑制膀胱癌细胞增殖、集落形成和侵袭，miR-1182通过结合其3'UTR直接靶向hTERT[18]。hTERT是端粒酶催化亚基，具有调控端粒酶活性和促进端粒延长的作用。端粒酶是细胞癌变过程中的重要调控因子，其无直接致癌作用，但是它具有促进肿瘤细胞周期，延长肿瘤细胞生存时间，进而促进肿瘤形成的作用。

综上，miR-1182在卵巢癌组织中低表达，而过表达miR-1182可抑制卵巢癌的增殖与侵袭，其通过靶向调节hTERT表达实现调控作用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突