一种新型复合碳纳米角电化学生物传感器用于PSA的高灵敏检测

2020-10-13冯德香

湖北第二师范学院学报 2020年8期

路勇，冯德香，浦春，尉艳

(皖南医学院检验学院，安徽芜湖 241002)

前列腺癌是一种男性泌尿系统疾病，它具有发展慢，发病隐匿等特点，早期无明显症状。前列腺特异性抗原有很好的组织特异性，可以提高前列腺癌的诊断准确性，也能够明确鉴别诊断前列腺癌和良性前列腺增生[1-2]。现有的前列腺癌检测技术虽然可以用于前列腺癌的诊断，但找寻更为有效的肿瘤标志物早期检测方法，是前列腺癌得以在早期被诊断和被有效治疗的关键。当前，对于肿瘤标志物的检测方法，电化学分析检测技术是研究中发展较快的一种，电化学方法具有灵敏度高、检测速度快和检测成本低等优点，因此常用于癌症的早期诊断研究。

在电化学分析检测技术中，构建检测性能优越的电化学传感器是此领域研究的关键问题。研究发现，单壁碳纳米角(Single-walled Carbon Nanohorns，SWCNHs)作为一种新型碳纳米材料，已经在高能燃料电池、气体储存和药物载体等方面的研究中被较多使用，具有广阔的应用前景[3-5]。单壁碳纳米角是碳的另一种异构体，其内径为2～4 nm[6]。因此，也有研究基于其优越的电化学分析性能，用碳纳米角作为基础材料来修饰电极，进一步应用于电化学传感[7-9]和新型荧光传感[10,11]等领域，取得了较好的研究成果，表明碳纳米角在电化学传感分析领域同样具有广阔的应用前景。本实验结合碳纳米角和金纳米棒来构筑碳纳米角复合检测平台，并将其用于前列腺特异性抗原的检测，表现出了较高的灵敏度和较好的选择性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

碳纳米角，壳聚糖(MW=1000000，deacetylation degree 80-95%)、氯金酸(HAuCl4·3H2O)购买于上海晶纯实业有限公司；K4Fe(CN)6·3H2O、FeCl3、KCl、牛血清蛋白(BSA)购买于中国科学院山西煤炭化学研究所；浓硫酸(95%-98%)购买于西陇化工股份有限公司；浓硝酸(65%-68%)购买于国药集团化学试剂有限公司；十六烷基三甲基溴化铵；硝酸银(AgNO3)；硼氢化钠(NaBH4)；抗坏血酸(ascorbic acid，AA)；前列腺特异性抗原抗体。

1.2 主要仪器

电化学工作台CHI660E(上海辰华仪器有限公司)。三极制：玻碳电极(GCE)(Φ=4mm)为工作电极，饱和甘汞电极为参考电极，铂丝电极为对电极。(SEM,JEOLJSM-4800F，日本日立公司)。数显恒温水浴锅(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司)。精密酸度计pHS-2F(上海雷磁仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 SWCNHs-COOH的制备

配制2.6mol/L的硝酸溶液300mL，将300mgSWCNHs和硝酸溶液放置于500mL圆底烧瓶中，加热至120℃，磁力搅拌回流48h。冷却至室温，加入去离子水稀释后，用孔径为0.45m的纤维素滤膜过滤，并用去离子水清洗至滤液pH=7.0。产物置于真空干燥箱中，40℃下真空干燥24h。

1.3.2 金纳米棒制备

用超声波将十六烷基三甲基溴化铵在5.0 mL去离子水中分散，制备种子液，准确称重0.365 g。将5.0毫升浓度0.001毫升的氯金酸溶液与上述分散剂充分混合后，加入新配制的0.01毫升冰凉NaBH4浓度0.9毫升溶液，搅拌2分钟。混合物立即由深黄色变为棕黄色，表明金种子已经形成，静置2 h备用。

生长液的制备：采用超声波技术，将十六烷基三甲基溴化铵在5.0 mL去离子水中分散，精确称重0.365 g。在硝酸银溶液中加入0.1 mol/L浓度的0.04 moL和5.0 mor/L含量的0.001 mols/L氯金酸液。然后加入0.10 mL0.8 mol/L浓度的抗坏血酸溶液，混合均匀后溶液由淡黄色变为无色。

制备：在上述生长液中加入0.012毫升种子液，摇晃2毫升，恒温25℃24 h，得到金纳米棒分散液。分散剂以14000 r/min的速度离心15 min，除去上清液，再用去离子水分散，离心2次备用。

1.3.3 修饰电极的搭建与检测

将裸GCE(Φ=4 mm) 分别用0.3 和0.05mAl2O3粉抛光成镜面，然后依次用浓硝酸(1 ∶1，V/V) 、无水乙醇和水超声清洗，氮气吹干，待用。如图1 所示，将2.0mg羧基化的碳角分散到0.1%的壳聚糖的水溶液中超声分散30min即可得到均匀分散的分散液，取此悬浊液6 l均匀滴加在处理好的GCE表面上，室温下自然晾干获得COOH-SWCNHs修饰电极。将COOH-SWCNHs/GCE放入10mM半胱氨酸盐酸盐(Cysteine，Cys)溶液即得到Cys/COOH-SWCNHs/GCE。随后，将电极在金溶胶中浸泡5h，电极表面通过金巯键作用连接金纳米棒(AuNRs)，便得到AuNRs/Cys/COOH-SWCNHs/GCE。将10.0μl 200μg·mL-1前列腺特异抗原抗体滴涂到电极上，4℃冰箱中过夜。将电极放入温度为37℃的1%BSA溶液中1h，在温度为37℃的条件下孵育30min，免疫反应完成后，将电极置于2.5mM K4Fe(CN)6·3H2O+2.5 mM FeCl3+0.1 M KCl溶液中，使用交流阻抗技术(EIS)、循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行测定，记录相应的结果曲线。

图1 新型复合碳纳米角生物传感器的制备过程及其对PSA的检测过程示意图

2 结果与讨论

2.1 碳纳米角复合生物传感器的表征

由图2A的SEM 图可见，碳纳米角呈现大丽花或芽状聚集体，比例尺为100纳米。采用循环伏安、电化学阻抗技术考察了电极表面修饰物对峰电流大小的影响及电化学性能的优化情况。如图2所示，在2.5mM K4Fe(CN)6·3H2O+2.5 mM FeCl3+0.1 M KCl溶液中，修饰电极有一对明显的氧化还原峰，以此修饰COOH-SWCNHs、Cys、AuNRs，峰电流明显增大。AuNRs/Cys/COOH-SWCNHs /GCE修饰电极上的氧化还原峰的峰电流最大。

图2 复合碳纳米角生物传感器的电化学表征图(A)循环伏安表征；(B)电化学阻抗谱表征。

2.2 实验条件优化

本文优化了免疫传感器检测时影响免疫传感器性能的实验参数(如孵化时间、温度等)。为了找到该免疫传感器发生免疫反应的最佳温度，将五个该传感器分别放在温度为16℃、25℃、37℃、45℃、53℃下进行检测，结果如图3(A)所示：在高温或低温条件下，传感器的电流响应均不佳，在37℃条件下，传感器的检测性能最好。因此，选择37℃为最优反应温度。

图3 传感器检测条件优化(A)温度优化;(B)反应时间优化

同时，我们还研究了抗原抗体免疫反应时间对检测效果的影响，图3 (B)所示：抗原抗体培养时间对感应器电流的影响较大，即捕捉到的抗原数量与反应时间有较大关系；并且随着孵育时间延长，传感器的电流值逐渐升高，当时间达到60min时电流值也趋于稳定，并且在60min之后电流值不再增加。因此，选择的最佳孵育时间为60min。

2.3 示差脉冲伏安法(DPV)检测抗原

采用最佳实验条件，在 pH7.0的 PBS溶液中，对不同浓度的前列腺癌特异抗原进行了免疫传感器示差脉冲伏安响应曲线的测试，结果见图4。实验结果表明，前列腺抗原的浓度在0.2-320ng·mL-1时，响应信号与浓度具有良好的线性关系，其回归方程为：I=0.46C-4.52，R2=0.993，检出限为3S/K=0.12 ng·mL-1。该免疫传感器具有良好的选择性，稳定性和重现性，预期可以用于前列腺癌的早期检测。

2.4 选择性检测

选择研究了检测前列腺癌特异抗原可能存在的干扰物(如：甲胎蛋白 AFP，葡萄糖，L-半胱氨酸)，其结果见图5柱状图。干扰物(50.0 ng×mL-1)的浓度是前列腺癌特异抗原(10.0ng-mL-1)的5倍，当传感器检测到任何一种干扰物混合了前列腺癌特异性抗原时，就会产生类似于相同浓度的前列腺癌特殊抗原的检测信号，这说明复合免疫传感器的选择性更好。