右美托咪定对缺血再灌注肺损伤大鼠NF-κB/COX2信号通路及细胞凋亡的影响*

余 丹， 李 鹏， 于明良， 陈彰强， 彭晓红

武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属普爱医院麻醉科，武汉 430033

肺缺血再灌注损伤是肺脏在缺血一段时间后，重新恢复血流时出现的肺损伤，常发生在心肺复苏、心脏手术、肺栓塞、肺移植、休克等临床手术及抢救治疗后，可造成肺细胞凋亡、坏死及肺水肿，引发呼吸功能障碍，是导致临床手术失败和患者死亡的主要原因[1-2]。缺血再灌注时中性粒细胞在肺部聚集，释放大量氧自由基，诱导促炎因子合成分泌，促使炎症发生发展，引起肺细胞凋亡和组织坏死，最终导致肺功能衰竭[2-3]。内毒素、氟化钠、氧自由基等可诱导NF-κB/COX2通路激活，促使炎症及氧化应激反应的发生及进展，在组织缺血再灌注损伤过程中发挥着重要作用。抑制COX2表达和NF-κB信号传导，可抑制炎症，减轻脑缺血再灌注所致的脑损伤[4-5]，据此推测NF-κB/COX2信号可能是改善缺血再灌注肺损伤的潜在作用靶点之一。右美托咪定是一种新型的麻醉药品，可明显减轻交感神经兴奋性，抑制机体代谢，减轻病痛，还能阻止脂多糖诱导的小鼠脑部神经炎症发生及进展，改善脑功能障碍，并可通过抑制自噬减轻缺血再灌注肺损伤[6-7]，但右美托咪定对缺血再灌注肺损伤大鼠NF-κB/COX2信号通路及细胞凋亡的影响，目前还不清楚。本文通过建立缺血再灌注肺损伤大鼠模型，对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠由汕头大学医学院提供，许可证号为SCXK(粤)2017-0017，体重220～260 g，在武汉市第四医院动物房饲养，环境保证清洁级，并保持安静、通风良好，温度25℃，相对湿度50%，适应性饲养1周后进行实验，严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》进行饲养和实验。

1.1.2 试剂与仪器 右美托咪定购自江苏恒瑞医药股份有限公司(批号12122501，规格2 mL/200 μg)；尼莫地平购自亚宝药业集团股份有限公司(批号20151017，规格20 mg)；TUNEL染色试剂盒、大鼠IL-18及IL-1β ELISA试剂盒、兔源GAPDH、IKK、p-IKK、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司(货号ab206386、ab213909、ab100768、ab181602、ab178870、ab38515、ab16502、ab86299)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京金克隆生物技术有限公司(货号RS3390)；BCA试剂盒、蛋白裂解液购自上海碧云天公司(货号P0011、P0013B)等。ABL80血气分析仪(丹麦雷度米特公司)；DHX-300动物呼吸机(成都仪器厂)；RM2035轮转切片机(德国Leica公司)；SMZ745光学显微镜(日本尼康公司)；Elx800酶标仪、1658033小型蛋白垂直电泳转印系统(美国Bio-Rad公司)；GelSMART凝胶成像仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备及分组给药 参照文献[8]：SD大鼠腹腔注射45 mg/kg的2.5%戊巴比妥钠进行麻醉，仰卧固定于鼠板，颈部备皮、消毒，在正中开口、分离气管，做气管插管，连接小动物呼吸机，进行机械通气，呼吸室内空气(潮气量8 mL/kg，呼吸频率80次/min，吸呼比1∶2)，然后切开右侧腹股沟，游离股动脉及股静脉，置入24G静脉留置针，给予100 U/kg肝素，于左侧第5肋间开胸，游离左肺门，暂停机械通气，以血管夹夹闭左肺动脉、左肺静脉及左主支气管，60 min后取下血管夹，适度进行膨肺，从而充分复张左肺。大鼠出现喘息、呼吸急促，检测动脉血气指标二氧化碳分压(PaCO2)明显增高，氧分压(PaO2)、氧合指数(OI)明显降低，表示模型建立成功。实验共建模64只，成功60只，随机分为模型组、右美托咪定低剂量组、右美托咪定中剂量组、右美托咪定高剂量组、尼莫地平组，每组12只，另取12只SD大鼠开胸后不夹闭左肺动脉、左肺静脉及左主支气管，其他操作相同，设为假手术组。

参照文献[9]，在造模成功后，右美托咪定各组分别给予0.75、1.50、3.00 μg/mL右美托咪定腹腔注射，注射剂量10 mL/kg，尼莫地平[10]以10 mL/kg的剂量灌胃20 mg/mL尼莫地平，模型组和对照组腹腔注射与右美托咪定高剂量组等剂量的生理盐水，每天1次，持续7 d。

1.2.2 标本采集及TTC染色 给药结束24 h后，麻醉大鼠后处死，经股动脉取血2 mL备用；迅速开胸分离双肺、气管及股动脉，剪断股动脉放血后向气管下段插入一个2 mL注射器针头，结扎固定，连接注射器向气管中缓慢注入1 mL生理盐水，待左肺膨隆，变得苍白时，缓慢回抽，然后所得液体再次缓缓注入，重复3次，最后所得液体于4℃离心5 min，收集上清，获得肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，储存在-80℃冰箱中备用；解剖取出肺脏，剪取约0.5 g储存于液氮中备用；其余肺组织以生理盐水漂洗后，置于4%多聚甲醛溶液中固定过夜，经梯度乙醇溶液(由低到高)脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后，使用切片机做常规病理切片备用。

1.2.3 动脉血气指标测定 1.2.2中的股动脉血放入全自动血气分析仪中，参照其说明书的操作步骤检测其中血气指标：PaO2、PaCO2，计算OI，公式为：OI=PaO2/FiO2(FiO2为吸氧浓度，本实验大鼠均吸入空气，FiO2为0.21)

1.2.4 肺部病理变化及细胞凋亡检测 选取1.2.2中完好、均匀的切片，经脱蜡、梯度乙醇溶液(从高到低)浸泡后，参照HE染色试剂盒及TUNEL染色试剂盒说明书的步骤进行染色，经再次漂洗、脱水、透明后，使用中性树胶封片，在光学显微镜下观察切片并拍照(每个切片随机选取5个视野)。

1.2.5 大鼠BALF中IL-18、IL-1β含量测定 1.2.2中BALF于冰水浴中解冻，参照ELISA试剂盒说明书的操作步骤测定其中IL-18、IL-1β含量。

1.2.6 肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白及凋亡蛋白Caspase-3表达检测 1.2.2中肺组织剪碎后置于干净试管中，加入蛋白样品匀浆，获得匀浆液，4℃离心20 min，收集上清，得到蛋白样品液参照BCA试剂盒说明书的步骤测定其中总蛋白浓度，煮沸变性后，各组分别取含相同质量总蛋白的样品液上样，进行SDS-PAGE电泳，分离蛋白，湿转，将全部蛋白转移至PVDF膜上，置于5%的脱脂奶粉中室温封闭2 h，按照分子量及蛋白Marker标记截取目的蛋白条带，分别置于兔源GAPDH、IKK、p-IKK、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗溶液中，于4℃冰箱孵育过夜，TBST漂洗，加入羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBST再次漂洗，采用增强化学发光法显色，将条带置于凝胶成像仪中拍照，并以Image J软件分析图片，得出各蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

所有数据均采用软件SPSS 24.0进行统计分析，计量数据采用均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 右美托咪定处理对大鼠动脉血气分析相关指标的影响

与假手术组相比，模型组大鼠PaCO2明显增高(P<0.05)，PaO2、OI明显降低(均P<0.05)；与模型组相比，右美托咪定低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠PaCO2降低(均P<0.05)，PaO2、OI增高(均P<0.05)，且右美托咪定各组之间呈剂量依赖性(均P<0.05)；右美托咪定高剂量组与尼莫地平组相比，大鼠PaCO2、PaO2、OI差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠动脉血气分析相关指标Table 1 Arterial blood gas related indexes of rats in each

2.2 右美托咪定处理对大鼠肺组织细胞凋亡的影响

与假手术组(15.02±3.01)%相比，模型组(75.76±10.23)%大鼠肺组织凋亡细胞比例明显增高(P<0.05)；与模型组相比，右美托咪定低(55.14±6.02)%、中(43.38±4.13)%、高剂量组(17.23±2.53)%及尼莫地平组(16.96±2.68)%大鼠肺组织凋亡细胞比例降低(均P<0.05)，且右美托咪定各组之间呈剂量依赖性(均P<0.05)；右美托咪定高剂量组与尼莫地平组相比，大鼠肺组织凋亡细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

A：假手术组；B：模型组；C：右美托咪定低剂量组；D：右美托咪定中剂量组；E：右美托咪定高剂量组；F：尼莫地平组图1 各组大鼠肺组织TUNEL染色结果(×400)Fig.1 Results of TUNEL staining in lung tissues of rats in each group(×400)

2.3 右美托咪定对大鼠肺组织病理形态的影响

假手术组肺组织肺泡结构清晰，无病理损伤；模型组大鼠肺组织呈现肺泡壁明显增厚，肺泡结构损坏，肺间质充血水肿，炎性细胞大量浸润等病理损伤表现；与模型组相比，右美托咪定低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠肺组织病理损伤减轻，且随右美托咪定剂量升高逐渐减轻；右美托咪定高剂量组与尼莫地平组相比，大鼠肺组织病理损伤程度无明显差异，见图2。

A：假手术组；B：模型组；C：右美托咪定低剂量组；D：右美托咪定中剂量组；E：右美托咪定高剂量组；F：尼莫地平组图2 各组大鼠肺组织HE染色结果(×400)Fig.2 Results of HE staining in lung tissues of rats in each group(×400)

2.4 右美托咪定对大鼠肺BALF中IL-18、IL-1β水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肺BALF中IL-18、IL-1β水平明显增高(均P<0.05)；与模型组相比，右美托咪定低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠肺BALF中IL-18、IL-1β水平降低(均P<0.05)，且右美托咪定各组之间呈剂量依赖性(均P<0.05)；右美托咪定高剂量组与尼莫地平组相比，大鼠肺BALF中IL-18、IL-1β水平差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肺BALF中IL-18、IL-1β水平Table 2 Levels of IL-18 and IL-1β in BALF of

2.5 右美托咪定对大鼠肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白及凋亡蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组大鼠肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白COX2表达水平及p-NF-κB p65、凋亡蛋白Caspase-3表达水平明显增高(均P<0.05)；与模型组相比，右美托咪定低、中、高剂量组及尼莫地平组大鼠肺组织COX2表达水平、p-NF-κB p65水平及Caspase-3表达水平降低(均P<0.05)，且右美托咪定各组之间呈剂量依赖性(均P<0.05)；右美托咪定高剂量组与尼莫地平组相比，各指标差异无统计学意义(均P>0.05)，见图3、表3。

A：假手术组；B：模型组；C：右美托咪定低剂量组；D：右美托咪定中剂量组；E：右美托咪定高剂量组；F：尼莫地平组图3 免疫印迹检测各组大鼠肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白及凋亡蛋白表达Fig.3 Detection of expression of NF-κB/COX2 pathway related proteins in lung tissue of rats in each group by Western blotting

表3 各组大鼠肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白及凋亡蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of expression levels of NF-κB/COX2 pathway related proteins in lung tissues of rats in different

3 讨论

肺部发生缺血再灌注时，肺微血管通透性明显增加，活性氧大量产生，可诱导强烈的免疫反应，激活促炎因子IL-18、IL-1β等表达，引起肺组织氧化及炎症损伤，造成肺细胞死亡，最终导致肺换气功能障碍[11-13]。PaCO2、PaO2及OI是反映血液氧合能力的血气指标，可用来判断肺换气功能是否正常[14]。本文结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织呈现肺泡壁明显变厚，肺泡结构损坏，肺间质充血水肿，炎性细胞大量浸润等病理损伤，提示模型建立成功。进一步观察发现，模型组大鼠凋亡细胞比例、动脉血PaCO2、BALF中IL-18及IL-1β水平明显升高，动脉血PaO2及OI明显降低，表明缺血再灌注可引发肺部炎症反应，诱导肺细胞凋亡，导致肺组织损伤和肺功能障碍。

目前缺血再灌注肺损伤尚无特别有效的防治手段，尼莫地平是临床中常用的治疗肺炎、缺血再灌注损伤的药物，可作为研究缺血再灌注肺损伤的阳性对照药[10，15-16]。右美托咪定作为一种高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，可用于镇静、麻醉，抑制H2O2诱导的Kupffer细胞氧化应激及炎症反应，还可通过抑制JAK2/STAT3通路减轻急性肺损伤，对脑、心、肺、肾等多种器官均具有保护作用[17-18]。本研究发现，以右美托咪定处理缺血再灌注肺损伤模型大鼠后，大鼠肺组织病理损伤减轻，凋亡细胞比例、动脉血PaCO2、BALF中IL-18及IL-1β水平降低，动脉血PaO2及OI升高，且呈剂量依赖性，表明右美托咪定可阻止炎症进展，抑制肺细胞凋亡，减轻缺血再灌注所致肺组织损伤，修复肺功能，并随剂量升高而作用增强。

在炎症、氧化应激、缺血再灌注损伤等多种病理过程中，NF-κB/COX2通路均处于激活状态，抑制NF-κB信号激活，可下调COX2表达，降低氧化应激水平，延缓炎症发生发展，减轻脑缺血再灌注损伤[19-20]，其中NF-κB被认为是炎症反应的中心环节，是缺血后炎症级联反应中最为重要的调控因子之一，而COX2是花生四烯酸代谢转化为前列腺素的催化酶，是炎症所致细胞毒性的关键因子。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织NF-κB/COX2通路相关蛋白及凋亡蛋白COX2、Caspase-3表达及p-NF-κB p65明显升高，经右美托咪定治疗后，肺组织COX2、Caspase-3表达及p-NF-κB p65降低，表明NF-κB/COX2信号可能参与肺缺血再灌注损伤过程，可能是由于右美托咪定通过阻断巨噬细胞中NF-κB核移位，抑制NF-κB活性，导致COX2被完全抑制，也可能是COX2被抑制后，COX2及其反应产物对NF-κB的正反馈调节作用被打断，阻滞该信号通路活化，进而抑制炎症反应，减轻肺损伤，改善肺功能障碍，但是其具体机制尚不明确，还有待进一步深入分析。

综上所述，右美托咪定抑制缺血再灌注肺损伤大鼠肺组织中NF-κB信号激活，下调COX2表达，减少肺细胞凋亡及减轻肺部炎症损伤，修复肺换气功能的具体作用机制可能是右美托咪定通过抑制NF-κB/COX2信号而实现的，但是本文只是对其药理机制进行了初步探讨，尚不能完全证明其具体作用机制，后续还需使用NF-κB/COX2通路抑制剂及激动剂进一步验证。