CCR5抗体对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制研究*

何望安， 王 茹， 沈 波， 金志刚， 吕学祥， 魏 丹， 金 晶， 余 成， 成 承

华润武钢总医院 1心内科 2老年病科，武汉 430080 3武汉大学人民医院心内科，武汉 430060

根据最新研究显示，心血管类疾病已成为严重威胁人类身体健康的头号杀手[1]。冠心病及严重的急性心肌梗死并发症是一种最常见的心血管疾病，长期临床实践表明，心肌缺血再灌注是成功治疗抢救冠心病患者的有效方法之一，但再灌注引起的心肌损伤对病患容易造成潜在的负面影响[2-3]。心肌缺血再灌注损伤是一种机体应激反应，可引起严重的局部或全身性炎症反应，会恶化心肌组织损伤，对心肌康复极其不利[4]。因此，尽快恢复缺血心肌组织血流供应的同时尽量避免缺血再灌注损伤的发生，是目前冠心病防治中研究的重点[5]。

趋化因子是一类小分子分泌蛋白，其产生具有组织特异性，越来越多的证据表明，趋化因子及其受体参与了心肌缺血再灌注损伤的发病过程[6-7]。正常情况下趋化因子受体5(chemokine receptor 5，CCR5)在人外周血单核细胞和T细胞中表达量非常低，受到体内外炎症刺激后其表达量显著上升[8]。CCR5表达量升高会介导中性粒细胞向再灌注部位大量聚集和粘附，并增强白细胞向心肌组织的定向渗透作用，是造成心肌缺血再灌注损伤的重要机制之一[9]。

本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，并分别使用CCR5拮抗剂及激动剂对该模型进行处理，从心功能水平、心肌损伤标记物、心肌组织结构、炎症相关因子及CCR5变化情况等方面观察心肌缺血再灌注损伤对心脏功能的影响，为今后冠心病等心血管类疾病的防治工作提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠由华中农业大学实验动物中心提供；3种心肌酶[肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)]检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；2种细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)]检测试剂盒、细胞间粘附分子(ICAM-1)兔抗大鼠抗体、伊红、苏木精、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸试剂盒购自Bioswamp公司；3种兔抗大鼠抗体[核转录因子(NF-κB)、CCR5及甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)]、过硫酸铵购自CST公司；羊血清、调节活化正常T细胞表达与分泌因子(RANTES)购自Sigma公司；PVDF转移膜、二氨基联苯胺显色试剂盒购自Millipore公司；Trizol、DNaseⅠ、反转录试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型建立 随机将60只健康大鼠平均分成5组：假手术组、缺血再灌注组、预缺血组、CCR5抗体组及CCR5激动剂组。腹腔注射麻醉剂后将其以背位固定，气管插管后通入动物呼吸装置；四肢皮下插入针形心电图电极连接心电检测仪，监测记录心电变化；连接多道生理信号记录分析系统以采集心功能相关指标。缺血再灌注组：在胸骨旁左侧第5肋间开胸，充分露出心脏部位，用弯针在左心耳下1～2 mm处，左冠状动脉前降支中上1/3处穿线，活结结扎，观察结扎远端心前壁变紫，心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段升高0.2 mV标志手术成功。结扎持续20 min后，经颈外静脉注射无水乙醇0.1 mL，满30 min时行再灌注2 h。预缺血组：先行结扎左冠状动脉前降支10 min后，松开10 min，共2个循环，结扎20 min后经颈外静脉注射无水乙醇0.1 mL，满30 min时行再灌注2 h。CCR5抗体组：结扎20 min后经颈外静脉注射浓度为0.2 mg/kg的CCR5抗体，满30 min时行再灌注2 h。CCR5激动剂组：结扎20 min后经颈外静脉注射浓度为0.1 mg/kg的RANTES作为CCR5激动剂，满30 min时行再灌注2 h。假手术组：在开胸经颈外静脉注射无水乙醇0.1 mL后仅做穿线处理。

1.2.2 大鼠心肌病理学染色观察 实验结束后取出大鼠心脏，剪去左心房和右心房，用预冷生理盐水冲净血液，拭纸拭干，用4 %多聚甲醛将一部分心肌固定48 h(另一部分进行深低温保存预留)。各组样本按常规步骤制备3 μm厚石蜡切片并编号，脱蜡水化，然后将奇数号的切片进行HE染色后置于光学显微镜下观察细胞结构变化。偶数号的切片用于免疫组化实验，微波加热修复抗原，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，羊血清孵育，按1∶200稀释比滴加ICAM-1一抗，4℃孵育过夜；PBS洗净，滴加二抗，二氨基联苯胺显色，用苏木精复染后置于光学显微镜下观察蛋白的组织定位和表达情况。

1.2.3 大鼠血清中心肌酶及细胞因子含量测定 于再灌注末从大鼠颈总动脉处取血，静置、离心处理后取上清，放入超低温冰箱冻存，严格按照试剂盒操作说明测定大鼠血清中心肌酶CK、AST、LDH及细胞因子TNF-α、IL-6的含量。

1.2.4 RT-PCR、Western blot分别测定大鼠心肌中mRNA及蛋白表达 取上述预留的大鼠心肌组织200 mg，提取组织总RNA并反转录，将制备好的cDNA进行扩增，反应程序为：95℃预变性3 min，95℃变性7 s，56℃退火延伸30 s，共45个循环(引物序列见表1)。另取上述预留的大鼠心肌组织200 mg，用预冷PBS溶液漂洗3次，接下来用细胞裂解液RIPA提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，分别以稀释比1∶2000、1∶1000、1∶1000加入NF-κB、CCR5、GAPDH一抗，4℃孵育过夜；洗膜后加入稀释比为1∶15000的二抗，常温孵育1 h，采用化学发光仪进行扫描并记录条带吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义；Lecia Applaction Stiue图像系统采集分析样本相关部位；Image Pro Plus图像分析软件读取样本平均积分吸光度值；Qbase Plus软件进行RT-PCR数据处理；Tanon Gis软件读取相关蛋白条带吸光度值，均以GAPDH为内参做相对定量分析。

2 结果

2.1 一般情况

总计5只大鼠在结扎左冠状动脉前降支术中因恶性心律失常死亡，3只大鼠因心电图无明显变化被排除，余下52只大鼠全部进入实验。

2.2 大鼠缺血再灌注后心功能水平的变化

相较假手术组，其他各组左室收缩压(LVSP)、左室内压最大变化率(±dP/dtmax)均明显降低，左室舒张末期压(LVEDP)明显升高；相较缺血再灌注组，预缺血组、CCR5抗体组LVSP、±dP/dtmax均明显升高，LVEDP明显降低，CCR5激动剂组LVSP、±dP/dtmax均明显降低，LVEDP明显升高；相较预缺血组，CCR5抗体组LVSP、±dP/dtmax均明显升高，CCR5激动剂组LVSP、±dP/dtmax均明显降低，LVEDP明显升高；相较CCR5抗体组，CCR5激动剂组LVSP、±dP/dtmax均明显降低，LVEDP明显升高。见表2。

表2 大鼠缺血再灌注后心功能水平的变化Table 2 Changes of cardiac function level after ischemia reperfusion in

2.3 大鼠缺血再灌注后血清中心肌酶及细胞因子含量的变化

相较假手术组，其他各组CK、AST、LDH、TNF-α、IL-6含量均有不同程度升高；相较缺血再灌注组，预缺血组、CCR5抗体组CK、AST、LDH、TNF-α、IL-6含量均明显下降，而CCR5激动剂组除LDH含量无显著性差异外，CK、AST、TNF-α、IL-6含量均明显上升；相较预缺血组，CCR5抗体组除TNF-α含量无显著性差异外，CK、AST、LDH、IL-6含量均明显下降，而CCR5激动剂组CK、AST、LDH、TNF-α、IL-6含量均明显上升；相较CCR5抗体组，CCR5激动剂组CK、AST、LDH、TNF-α、IL-6含量均明显上升。见表3。

表3 大鼠缺血再灌注后血清中心肌酶及细胞因子含量的变化Table 3 Changes of myocardial enzyme and cytokine content in rats’serum after ischemia

2.4 大鼠缺血再灌注后心肌病理学染色的变化

HE染色观察发现，相比假手术组，缺血再灌注组、CCR5激动剂组心肌细胞排列紊乱，细胞核呈不规则浓缩状，心肌纤维变形严重结构不完整，间质水肿明显伴有大量中性粒细胞浸润，炎症表现突出，其中CCR5激动剂组表现更重；而预缺血组和CCR5抗体组大部分心肌细胞排列整齐，心肌纤维变性和间质肿胀轻微，仅出现少量中性粒细胞浸润，炎症表现较弱，其中CCR5抗体组表现减弱更明显。见图1。

免疫组化检测大鼠心肌组织中ICAM-1的阳性表达情况，结果显示，与假手术组(1235.71±144.54)比较，缺血再灌注组(5793.52±188.36)、CCR5激动剂组(8766.35±225.44)中ICAM-1的表达明显升高(均P<0.05)；与缺血再灌注组比较，预缺血组(3125.84±136.25)和CCR5抗体组(2917.63±251.31)中ICAM-1表达明显下降(均P<0.05)。见图2。

A：假手术组；B：CCR5激动剂组；C：预缺血组；D：缺血再灌注组；E：CCR5抗体组图1 大鼠缺血再灌注后心肌病理形态学的变化(苏木精-伊红染色)Fig.1 The pathological changes of myocardium in rats after ischemia reperfusion (HE Staining)

A：假手术组；B：CCR5激动剂组；C：预缺血组；D：缺血再灌注组；E：CCR5抗体组图2 大鼠缺血再灌注后心肌中ICAM-1表达的变化(免疫组化染色)Fig.2 The protein expression changes of ICAM-1 in rats’myocardium after ischemia reperfusion(Immunohistochemical Staining)

2.5 大鼠缺血再灌注后心肌中NF-κB、CCR5 mRNA及蛋白表达的变化

结果表明，相较假手术组，其他各组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显升高；相较缺血再灌注组，预缺血组、CCR5抗体组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显下降，而CCR5激动剂组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显上升(均P<0.05)；相较预缺血组，CCR5抗体组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显下降，而CCR5激动剂组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显上升(均P<0.05)；相较CCR5抗体组，CCR5激动剂组NF-κB、CCR5 mRNA水平均明显上升。各组在NF-κB、CCR5蛋白表达水平上也同样符合上述规律。见图3、图4。

与假手术组比较，*P<0.05；与缺血再灌注组比较，#P<0.05；与预缺血组比较，※P<0.05；与CCR5抗体组比较，△P<0.05图3 大鼠缺血再灌注后心肌中NF-κB、CCR5 mRNA表达的变化Fig.3 The mRNA expression changes of myocardium in rats after ischemia reperfusion

与假手术组比较，*P<0.05；与缺血再灌注组比较，#P<0.05；与预缺血组比较，※P<0.05；与CCR5抗体组比较，△P<0.05图4 大鼠缺血再灌注后心肌中蛋白表达的变化Fig.4 The protein expression changes in myocardium of rats after ischemia reperfusion

3 讨论

心肌缺血再灌注会激活体内炎症反应，而CCR5通过与趋化因子结合能够促进炎性细胞在组织中的粘附聚集，进而加剧炎症“瀑布效应”造成心肌不可逆损伤[10]。心肌发生缺血再灌注损伤后，心肌细胞对缺血缺氧的耐受能力减退，能量供给出现障碍，导致心脏舒张和收缩功能失调、心律失常[11]。目前，临床上通常检测LVSP、LVEDP以及±dP/dtmax等指标来评价心肌的舒张和收缩功能。本研究结果显示，缺血再灌注组和CCR5激动剂组大鼠LVSP、±dP/dtmax明显下降，LVEDP则明显升高，说明其心功能水平恶化。而CCR5抗体组LVSP、LVEDP以及±dP/dtmax明显改善，提示CCR5抗体能够显著缓解缺血再灌注大鼠的心脏舒张和收缩功能障碍，改善缺血再灌注大鼠的心脏血流动力学水平，提高心肌细胞功能，减轻心肌损伤程度。

心肌缺血再灌注损伤的组织细胞膜通透性发生改变，会引起细胞变性或坏死，致使胞内大量心肌酶如CK、AST、LDH等漏出进入外周血，因此血清中心肌酶活性升高程度可作为早期诊断心肌缺血再灌注损伤严重性的指标之一[12-13]。在本次研究中，CCR5抗体组CK、AST、LDH水平均显著减轻，说明其对心肌起到保护作用。此外，CCR5抗体对心肌的保护效果优于预缺血组，提示CCR5抗体可能通过降低细胞膜通透性，防止心肌酶大量释放来减轻心肌损伤程度。HE染色结果显示，经CCR5抗体处理过的心肌细胞和组织的病变程度明显轻于CCR5激动剂组和缺血再灌注组，再次验证CCR5抗体能够显著提高心肌的保护作用。

缺血再灌注损伤通过刺激一些能够诱导炎症细胞粘附因子表达增强的细胞因子，激活核转录因子，促进炎症介质产生，促使白细胞定向移动到炎症组织中，进而引起炎症反应[14-15]。其中ICAM-1是一种重要的粘附因子，可在心肌细胞表面粘附中性粒细胞等炎性细胞，加重心肌损伤程度；细胞因子以TNF-α、IL-6为主[16]，TNF-α参与心肌损伤的发生和发展，趋化中性粒细胞聚集，IL-6的过表达在心肌缺血再灌注损伤的保护机制中起负面影响，诱导心肌细胞凋亡；核转录因子NF-κB参与心肌损伤中多种炎症介质的信号通路转导。心肌缺血再灌注损伤会诱发TNF-α高表达，TNF-α可活化NF-κB、刺激ICAM-1产生，活化的NF-κB又可进一步促进TNF-α、IL-6、IL-8、ICAM-1等基因的转录翻译，它们彼此影响相互促进，导致越来越多的淋巴细胞及中性粒细胞被吸引趋化至心肌组织处粘附、聚集，从而反复加剧心肌细胞和血管内皮细胞损伤[17-18]。已有文献报道，通过抑制TNF-α表达[19]，抑制NF-κB[20]及粘附因子的活化[21]，可有效防止和减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。本研究结果显示，CCR5激动剂组和缺血再灌注组血清中TNF-α、IL-6含量，ICAM-1蛋白表达，以及NF-κB、CCR5的mRNA和蛋白表达均明显升高，而CCR5抗体组及预缺血组中相应指标均明显降低。提示CCR5抗体是通过干扰趋化因子与其受体的结合并降低TNF-α、IL-6含量，减轻心肌细胞内NF-κB的活化并抑制ICAM-1的表达，削弱炎症细胞(主要是中性粒细胞)在组织中的聚集粘附作用，来实现对心肌细胞的保护。

综上所述，CCR5抗体能对缺血再灌注大鼠的心脏发挥明显的减轻损伤和保护作用，为心肌缺血再灌注损伤的防治工作提供了理论基础和方向。