硫化氢通过TLR4/NF-κB通路改善MPP+所致SH-SY5Y细胞炎症性损伤*

曹 旭， 黄若兰， 陈小武

1 深圳大学总医院神经内科，深圳 518055 2 深圳市人民医院神经内科，深圳 518020

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年人的慢性进行性神经系统变性疾病。其主要病理生理学特征是中脑黑质致密部(substantia nigral compacta，SNc)多巴胺(Dopamine，DA)能神经元变性死亡，主要的临床特征为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势步态异常[1]。多巴胺能神经元选择性死亡的机制目前尚不明确，遗传、炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒性等多种因素都与PD密切相关[2]。在其复杂的病理机制之上，我们对PD的治疗既要统观全局又要抓住重点，这也是寻找及研究新的、多靶点的治疗药物之基础。

1996年Abe等[3]提出H2S作为一种神经调质而发挥重要作用，这一里程碑式的发现促使H2S成为近20年来生物医学领域研究的“明星”分子。H2S广泛参与哺乳动物多系统生理和病理过程的调节，如调节多种细胞内信号分子、调节细胞表面离子通道、调节神经递质的释放、抗氧化和抗炎作用[4-6]。我们前期研究发现一定浓度的外源性H2S可以改善帕金森病细胞模型的氧化应激[7]，但其对神经细胞炎症性损伤的影响及机制目前尚不明确。本研究采用硫氢化钠(sodium hydrogen sulfide，NaHS)作为外源性H2S供体[8]，拟观察H2S对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，购自中国科学院细胞库。SH-SY5Y细胞置于含5%CO2的37℃培养箱，以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养，每2～3天更换培养液，当细胞铺满瓶底70%左右时，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代培养。

1.2 实验分组

本实验设计共分3组：①对照组，正常培养液培养，不加任何处理试剂；②MPP+组，SH-SY5Y细胞培养至对数期后，以500 μmol/L的MPP+处理24 h[9]；③NaHS+MPP+组，参考本课题组既往对NaHS的剂量效应研究[7]，以400 μmol/L的NaHS预处理30 min后，再加用500 μmol/L的MPP+继续处理24 h。每组各设定5个检测样本(n=5)以进行统计学分析。

1.3 CCK-8法检测细胞活力

将对数生长期的SH-SY5Y细胞以4×104/孔(100 μL/孔)左右的密度接种于96孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养24 h，然后按1.2所述方法分组处理；每孔加入10 μL CCK-8工作液(YEASEN，Japan)，以37℃孵育3 h后，使用酶标仪(BioTek synergy2，USA)检测各孔450 nm波长处吸光度值(A)。细胞活力的计算公式为：细胞活力(%)=(实验组A均值/对照组A均值)×100%。

1.4 末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TDT)介导的缺口末端标记染色法(TUNEL法)检测细胞凋亡

使用一步法原位细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术公司)，按说明书步骤操作。取置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞，吸去培养液，加入4%多聚甲醛固定30 min；1%PBS洗1次后再向各孔中加入含1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2 min；在样品上加入50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，封片后立即在荧光显微镜下观察。高倍镜下随机取5个视野，计数呈现绿色荧光的凋亡细胞，取平均值，计算细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)：AI=凋亡细胞数/视野下细胞总数×100%。

1.5 Griess试剂盒检测细胞培养液中的亚硝酸盐浓度

取置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞，按Griess试剂盒(碧云天生物技术公司)说明书步骤检测细胞培养液中的亚硝酸盐(NO的代谢物)。将悬浮的细胞培养液与Griess试剂按1∶1混匀，室温下孵育10 min，使用酶标仪在540 nm波长下检测各孔吸光度，根据标准曲线计算NO释放量。

1.6 ELISA法检测炎症因子水平

利用ELISA试剂盒(杭州联科生物公司)检测各组细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。收集置于96孔板中经处理的各组SH-SY5Y细胞的上清液后，按照试剂盒说明书步骤进行操作。用酶标仪在450 nm处测量其吸光度。根据绘制的标准曲线计算各组细胞上清液中炎症因子浓度。

1.7 Western blot检测蛋白表达

用EDTA分别消化各组细胞，并在1500 r/min转速下离心收集，PBS漂洗2次，按说明书提供步骤，分别用细胞核蛋白与细胞总蛋白抽提试剂盒(碧云天公司，上海)提取SH-SY5Y细胞核蛋白和胞质蛋白。提取的蛋白加入上样缓冲液，100℃煮沸10 min并于4℃保存。以Bradford法测定蛋白浓度。每组取等量的蛋白样本在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳(建成生物公司，南京)，并转移到硝酸纤维素膜(Pell公司，USA)，TBST洗膜3次后，用含有5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，再予TBST充分洗涤，加入适量一抗4℃孵育过夜。各种抗体孵育浓度如下：Toll样受体4(TLR4)抗体(1∶2000，Abcam，UK)，NF-κB抗体(1∶1000，Cell Signaling Technology)，p-NF-κB抗体(1∶1000，Cell Signaling Technology)，GAPDH抗体(1∶2000，Santa Cruz，USA)，IκBα抗体(1∶2000，Abcam，UK)，p-IκBα抗体(1∶2000，Abcam，UK)，iNOS抗体(1∶1000，Cell Signaling Technology)，一抗孵育完成后经TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶结合的二抗(博奥森公司，北京)置于摇床室温孵育1 h，TBST充分洗涤后，以ECL法显色，胶片暗室曝光显影。NIH图像软件对各条带吸光度进行分析。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 H2S改善MPP+所致的SH-SY5Y细胞活力降低

CCK-8法检测细胞活力结果显示，予500 μmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞24 h后，细胞活力下降至(47.84±4.96)%(P<0.05)。而400 μmol/L 浓度的NaHS预处理使细胞活力升高到(68.92±8.68)%，高于MPP+单独处理组(P<0.05)。提示400 μmol/L的NaHS可改善MPP+导致的SH-SY5Y细胞活力下降。

2.2 H2S减少MPP+导致的SH-SY5Y细胞凋亡

TUNEL染色检查SH-SY5Y细胞凋亡，凋亡细胞中断裂的DNA 3′-OH末端可以在末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)的催化下与标记绿色荧光探针荧光素标记的dUTP(fluorescein-dUTP)结合，使细胞核呈现绿色信号。如图1所示，对照组未见明显的TUNEL阳性染色，MPP+组可见明显增多TUNEL阳性染色，NaHS预处理组TUNEL阳性染色细胞明显少于MPP+组。定量计数表明，MPP+组及NaHS+MPP+组的细胞凋亡指数分别为(51.44±7.68)%和(33.69±10.96)%，两组凋亡指数差异有统计学意义(P<0.05，图1)，显示H2S具有抑制细胞凋亡的作用。

与对照组比较，*P<0.05；与MPP+组比较，#P<0.05；n=5图1 H2S对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响Fig.1 Effects of H2S on the apoptotic rate of SH-SY5Y cells induced by MPP+

2.3 H2S减少MPP+所致SH-SY5Y细胞炎症因子释放

我们以细胞上清中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量来评估细胞的炎症水平。与对照组相比，MPP+组细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α及NO含量明显升高(均P<0.05)。经400 μmol/L NaHS预处理后，所测各炎症因子含量均明显下降；而NaHS+MPP+共处理组细胞上清中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均较对照组增高(P<0.05，表1)。

表1 H2S对SH-SY5Y细胞炎症因子水平的影响Table 1 Effects of H2S on the inflammatory factors of SH-SY5Y

2.4 H2S对MPP+激活的SH-SY5Y细胞中iNOS、TLR4、NF-κB、IκBα蛋白的影响

各种刺激因素可导致细胞TLR4信号通路活化从而促进炎症因子释放。免疫印迹法检测结果表明：与对照组比较，SH-SY5Y细胞经MPP+单独处理后iNOS蛋白、TLR4蛋白的表达水平显著升高(均P<0.05)；与MPP+组相比，NaHS预处理后可显著降低iNOS和TLR4蛋白表达水平(均P<0.05，图2A、2B)。

TLR4信号通路活化可导致IκBα磷酸化，后者与NF-κB脱离，NF-κB磷酸化并核转位后介导多种炎症因子转录表达。对IκBα和NF-κB磷酸化水平检测发现，3组细胞间，总IκBα和总NF-κB p65表达变化无显著差异。而与对照组相比，MPP+单独处理组中p-IκBα和p-NF-κB p65表达均明显增多(均P<0.05，图2C、2D)。NaHS预处理组与MPP+单独处理组相比，p-IκBα和p-NF-κB p65表达减少，差异有统计学意义(均P<0.05，图2C、2D)。

与对照组比较，*P<0.05；与MPP+组比较，#P<0.05；n=5图2 H2S对MPP+激活的SH-SY5Y细胞中TLR4/NF-κB通路的影响Fig.2 Effects of H2S on MPP+ stimulated activation of TLR4/NF-κB pathway in SH-SY5Y cells

3 讨论

目前PD发病和慢性进展机制仍不清楚。PD患者尸检和动物模型研究均提示，神经炎症反应是帕金森病多巴胺能神经元损伤的重要因素之一[10]。TLR4是广泛分布于多种细胞的一种独特的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)[11]。TLR4通过识别特定的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PMAPs)并与之结合，引发一系列信号转导，尤其是激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，介导炎症因子的释放，因此在天然免疫防御方面发挥重要作用[12]。研究显示在α-SYN病患者和小鼠模型中TLR4表达显著升高，TLR4/NF-κB通路激活在PD动物模型中参与多巴胺能神经元变性[13]。而TLR4缺陷小鼠可抵抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)毒性，这表明多巴胺能神经元死亡是TLR4依赖性的[14]。

SH-SY5Y细胞是一种衍生于人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH的低分化肿瘤细胞，可表达儿茶酚胺能神经元特有的酪氨酸羟化酶、多巴胺羟化酶和多巴胺转运体等，被广泛运用于神经系统疾病尤其是PD的研究。MPTP是一种能够影响细胞内能量消耗和自由基产生的神经毒素[15]，MPP+是MPTP在单胺氧化酶作用下产生的活性代谢产物。MPP+通过多巴胺转运体被选择性摄取到多巴胺神经元内，可导致细胞死亡，常用于制备帕金森病细胞模型[16]。

本研究以500 μmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型，发现SH-SY5Y细胞的存活率下降，凋亡率增加，细胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NO等炎症因子释放增加，iNOS蛋白表达增高；TLR4增高，IκBα和NF-κB磷酸化增多。我们推断可能是MPP+的神经毒性作用导致TLR4/NF-κB通路激活，从而出现下游一系列炎症因子的释放和对SH-SY5Y细胞的二次损伤。

继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)先后被证实为信使分子后，H2S也被发现为存在于哺乳动物体内的新型气体信号分子或称为气体信使。类似于NO，H2S具有一系列生理功能，例如血管扩张、调节细胞凋亡和增殖等[17]，广泛参与多系统生理和病理过程。2007年，Hu等[18]首次报导了NaHS的抗炎作用，发现H2S可以抑制细菌脂多糖对小胶质细胞与星形胶质细胞的诱导激活，抑制NO与TNF-α等炎症因子释放。Whiteman等[19]继而发现H2S缓释剂GYY4137也具有抑制炎症作用。他们发现H2S不仅抑制促炎症介质的释放，同时还促进抗炎因子如IL-10的合成。其抗炎机制主要与抑制NF-κB和p38/JNK信号通路有关。这些证据提示H2S及可释放H2S的化合物均具有明显的抗炎作用，其作为药物组分可能在神经变性病的治疗中颇具前景[20]。本研究以NaHS作为H2S供体，对SH-SY5Y细胞进行预处理后，再予500 μmol/L MPP+，检测发现NaHS预处理可以部分逆转MPP+所致SH-SY5Y细胞存活率下降和细胞凋亡。为明确H2S的细胞保护作用是否与炎症控制相关，我们观察了IL-1β、IL-6、TNF-α等多个炎症因子水平，发现NaHS预处理可明显抑制MPP+所致上述炎症因子释放，并减少iNOS表达，降低NO释放。我们用Western blot检测TLR4、IκBα、NF-κB蛋白的表达，结果表明NaHS预处理明显抑制了MPP+所致SH-SY5Y细胞中TLR4增高和IκBα和NF-κB磷酸化，证实H2S对TLR4/NF-κB通路有调控作用。

综上所述，我们的研究提示，H2S可改善MPP+神经毒性作用，其相关机制是通过抑制TLR4/NF-κB通路，以及该通路活化所致的瀑布式炎症反应过程，从而减少MPP+所致细胞凋亡。本研究为应用气体信使H2S改善PD的神经细胞炎症性损伤提供了一定的体外实验依据，在以后的实验中可进一步通过体内研究探索H2S对PD神经炎症的保护作用及相关的药理学靶位。