去甲乌药碱对过氧化氢引起的PC12细胞损伤的保护作用研究

成蒙蒙，冯正平，杨彦玲*

(1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；2.陕西师范大学，陕西 西安 710119)

神经损伤是导致阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等神经退行性疾病及脊髓损伤、脑缺血、脑缺血再灌注损伤等病理性疾病的重要原因[1]。氧化应激诱导的神经细胞凋亡是神经损伤的关键因素。

PC12细胞是常见的研究神经生理和神经药理的细胞之一[2]，过氧化氢(H2O2)诱导细胞损伤是目前研究神经细胞氧化应激损伤常见的细胞模型[3]。通过该模型，可以有效的探讨阿尔兹海默症(AD)[4]、帕金森病(PD)[5]、脊髓损伤[6]和脑缺血[7]发病机制及治疗手段。

去甲乌药碱是中药附子的提取物，现代研究表明，去甲乌药碱具有正心肌、强心[8]、舒张支气管[9]、免疫调节[10]、抗炎[11]、抗氧化、抗凋亡[12]等作用。临床上主要用于强心和治疗心律失常。目前研究表明去甲乌药碱能有效保护由脑缺血再灌注诱导的神经细胞损伤[13]，同时发现去甲乌药碱能有效清除氧自由基活性[14]。本研究利用过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞建立氧化应激损伤模型，探讨去甲乌药碱对氧化应激的保护效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

PC12细胞购于中国科学院上海细胞库，去甲乌药碱盐酸盐(上海源叶生物公司)，RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、青链霉素(双抗)、谷氨酰胺(GLUMax)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Gibco公司，H2O2(陕西欣通化工公司)，PBS缓冲液(北京索莱宝公司)，丙二醛试剂盒(MDA)、超氧化物歧化酶试剂盒(SOD)均购自南京建成生物工程研究所，TUNEL试剂盒(ROCH公司)，Caspase3、Bax、Bcl-2及Tubulin一抗和HRP标记的兔二抗(武汉三鹰公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞培养 将PC12细胞培养于CO2恒温(37℃)饱和湿度的培养箱中，培养液为含有10%胎牛血清、1%青链霉素、1%谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，每2～3 d换培养液，消化采用0.25%的胰蛋白酶，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 分组及处理 实验共设3组，对照组、H2O2组、去甲乌药碱组，去甲乌药碱组预先给予50 μM的去甲乌药碱24 h，接着H2O2组和去甲乌药碱组分别给予100 μM的H2O2处理6 h，对照组给予等体积培养基进行培养。

1.2.3 细胞存活率测定 用CCK8法检测细胞存活率，取对数生长期的PC12细胞，按105个细胞/mL接种至96孔板，培养24 h后，弃去上清，对照组加100 μL培养基，H2O2处理组分别加等体积的终浓度为10、50、100和200 μM的H2O2的培养基溶液，去甲乌药碱处理组分别加等体积的终浓度为5、10、50、和100 μM的去甲乌药碱培养基溶液，每组做9个平行副孔。分别继续培养24 h，每孔再加入10 μL的CCK8继续孵育1 h后，用酶标仪对各孔在波长450 nm处吸光度值进行检测。

1.2.4 流式检测ROS 在六孔板中采用1.2.3项下方法处理PC12细胞后，用0.25%的胰蛋白酶消化，4000 r/min，离心5 min，收集细胞，加PBS制成细胞悬液，参照ROS试剂盒说明书进行样品制备，上机检测。

1.2.5 MDA、SOD测定 在六孔板中采用1.2.3项下方法处理PC12细胞后，收集培养液备用，用无菌PBS洗3遍，用0.25%的胰蛋白酶消化，4000 r/min，离心5 min，收集细胞，用1 mL PBS洗1遍，然后加细胞裂解液RIPA裂解细胞，低温(4℃)离心10 min，收集上清液，参照南京建成生物工程研究所提供的相应试剂盒说明书，检测细胞内MDA含量及SOD活性。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 各组细胞培养时加入细胞爬片，按1.2.3项下方法处理PC12细胞后。将各组爬片于4%多聚甲醛固定，以Streptavidin工作液覆盖孵育样品，DAPI复染封片。200倍显微镜下观察，细胞核呈黄色为阳性的凋亡细胞。

1.2.7 Western blot检测细胞Bax、Bcl-2及Caspase3蛋白表达 在六孔板中采用1.2.3项下方法处理PC12细胞后，收集细胞，加RIPA冰上裂解，收集上清液，即是总蛋白，Bradforrd试剂盒测定总蛋白浓度，蛋白变性，电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温孵育2 h进行封闭，一抗溶液，稀释度皆为(1∶1000)4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，稀释度为(1∶2000)，显色液A∶B液按1∶1显色，凝胶成像系统中曝光。

1.3 统计学方法

采用Graphpad 5.0统计软件，实验数据经单因素方差分析(One-wayANOVA)表示，组间比较采用Tukey’s Multiple Comparisons Test，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 去甲乌药碱对H2O2引起的PC12细胞活力的影响

不同浓度的H2O2(10，50，100，200 μM)处理PC12细胞6 h后，CCK8结果显示(见图1A)，与对照组比较，浓度为100和200 μM的H2O2能显著降低PC12细胞的活性(P<0.001)；处理12 h后，50 μM浓度的H2O2也能显著降低PC12细胞的活性(P<0.001)；浓度为10 μM的H2O2在处理24 h后也出现了降低PC12细胞的活性的现象(P<0.001)。因此，本研究中选择100 μM的H2O2处理PC12细胞6 h为造模参数进行后续实验。

PC12细胞用不同浓度的去甲乌药碱(5，10，50，100 μM)处理24 h后，结果显示(见图1B),不同浓度的去甲乌药碱对细胞没有显著性差异，表明在100 μM以下的去甲乌药碱对PC12细胞没有明显影响。

PC12细胞用不同浓度的去甲乌药碱(5，10，50，100 μM)预处理24 h后，用100 μM的H2O2处理PC12细胞6h。结果显示(见图1C)，浓度为10，50和100 μM的去甲乌药碱能显著升高PC12细胞的活力(P<0.05)，然而，浓度为100 μM的去甲乌药碱预处理后，细胞活力出现相对降低的趋势。同时，如(见图1D)显示，浓度为50 μM的去甲乌药碱预处理后PC12细胞在Control+Hig组和H2O2+Hig组均呈现较好的细胞状态。因此，本研究中选择50 μM的去甲乌药碱预处理PC12细胞为给药参数进行后续实验。

2.2 去甲乌药碱对H2O2诱导的PC12细胞中ROS、MDA及SOD活性的影响

采用流式细胞仪检测ROS水平，结果显示(见图2A)，与对照组比较，H2O2组峰值右移，说明H2O2处理能诱导PC12细胞中ROS水平增加。然而，与H2O2组比较，去甲乌药碱预处理后峰值左移，说明去甲乌药碱可以减少H2O2诱导ROS水平增加。

采用TBA法检测细胞膜脂质过氧化程度，即MDA的含量，结果显示(见图2B)，与对照组比较，H2O2组MDA含量显著升高(P<0.001)，与H2O2组比较，去甲乌药碱组MDA含量降低(P<0.01)，说明H2O2增加了MDA含量，去甲乌药碱可以减少H2O2诱导MDA含量的升高。

采用WST法检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性，结果显示(见图2C)与对照组比较，H2O2组SOD活性显著降低(P<0.05)，与H2O2组比较，去甲乌药碱组SOD活性显著升高(P<0.05)，说明H2O2减少了MDA含量，去甲乌药碱可以增加H2O2诱导SOD活性的减少。

2.3 去甲乌药碱对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响

采用Tunel/DAPI荧光双染来检测细胞凋亡，结果见封二图3A，蓝色荧光为DAPI阳性细胞，绿色为Tunel阳性细胞，Merge后黄色为凋亡细胞。Tunel/DAPI双染的统计学分析，结果见封二图3B，与对照组比较，H2O2组细胞凋亡率显著提高(P<0.01)；与H2O2组比较，去甲乌药碱组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。

2.4 去甲乌药碱对H2O2诱导的PC12细胞中Caspase3、Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

采用Western blot法检测凋亡相关蛋白，即Caspase3、Bax及Bcl-2蛋白，结果见图4，与对照组比较，H2O2组Caspase3、Bax/Bcl-2表达量增加，与H2O2组比较，去甲乌药碱组中Caspase3、Bax/Bcl-2表达量显著减少。

3 讨论

神经系统受到外伤，缺氧缺血及病理性有害刺激时，诱导氧自由基如ROS的大量生成，可能通过破坏脂质过氧化和共价键引起神经细胞的损伤，凋亡，进而诱发或加重疾病的进程。自由基清除剂，例如SOD和GSH，可以清除过量的氧自由基，有效保护细胞免受损伤。本研究中，与对照组比较，100 μMH2O2诱导的PC12细胞6 h后，ROS活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.001)。表明H2O2诱导PC12发生脂质过氧化。然而，50 μM去甲乌药碱预处理PC12细胞2 h后，显著降低MDA含量(P<0.05)，ROS活性(P<0.05)，并增加SOD活性(P<0.05)。暗示去甲乌药碱可以降低H2O2诱导的PC12的脂质过氧化和提高自由基清除能力。学者在大鼠原代海马神经元细胞[11]、C6细胞[12]中也得到类似结果。

过量的氧化应激可以引起细胞凋亡。本研究也证实去甲乌药碱预处理后能明显提高PC12的活性(P<0.05)，同时Tunel染色也进一步验证其能有效保护PC12细胞。凋亡途径又分为两种，一是细胞外途径即死亡受体通路(或肿瘤坏死因子通路)，通过细胞表面的死亡受体与其相应的配体(如Fas和TNFα)结合导致caspase-8、10激活，以至激活caspase-3、6、7[15]。另一途径是细胞内途径即为线粒体依赖的凋亡途径，各种凋亡诱导信号，特别是氧化应激和DNA损伤，直接或者间接改变线粒体膜通透性，导致细胞色素C释放入胞浆，作用于caspase-9以至下游caspase-3[16]。两途径均可使caspase-3激活，caspase-3是通路枢纽,活化的caspase-3将被剪切成多个片段，这些剪切片段可以导致DNA的断裂和细胞凋亡的一系列特征的形成。H2O2诱导的PC12细胞发生凋亡,即氧化应激介导细胞凋亡，启动了第二条凋亡途径，Bcl-2家族在线粒体参与的凋亡途径中起重要的调控作用，而caspase-3又是两条途径的枢纽，因此我们检测了这几个标志性蛋白bax、Bcl-2和Caspase3。有研究证实H2O2诱导的PC12细胞中Caspase3活性提高，Bax表达量上调，Bcl-2表达量下调[17]。本研究结果表明，去甲乌药碱能预处理后显著上调Bcl-2表达，下调Caspase3和Bax表达。表明去甲乌药碱可能通过激活Bcl-2蛋白活性，进而抑制Caspase3的活性，最终抑制H2O2诱导的PC12细胞发生凋亡。

因此，去甲乌药碱能够抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤，与去甲乌药碱的抗氧化及抗细胞凋亡有关，但其具体机制还需要进一步研究。