海洋微生物宏基因组学研究进展

胡 敏，李 雪，支红欣，彭 勃,刘雨心,王玉庭,宋思杭

(大庆师范学院 生物工程学院，黑龙江 大庆 163712)

1 引言

海洋是最大的水生生态系统，具有巨大的开发潜力。由于许多微生物处于海洋极端环境中，如高压、高温、低温等，运用传统的技术很难对这些微生物进行研究，因此利用宏基因组技术可以为海洋微生物多样性以及生物技术的应用创造新机遇。

1.1 海洋微生物研究进展

海洋真菌属于海洋微生物的一个重要组成部分。根据国内外研究表明，至今还有20000～40000种真菌没有被开发和研究。2005年，中山大学生命科学院王书锦在中国黄海、渤海、辽宁近海地区共分离出500多株海洋真菌，并对其中20多种进行鉴定，主要的真菌有青霉属(Penicillum)、曲菌属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)。

除真菌以外，许多海洋微生物可以产生抗肿瘤活性物质。在辽宁近海地带的8个地区，薛德林等分离出8株海洋酵母菌、5株海洋真菌，其中真菌中青霉属菌株HF9601、HF9602、HF9603中有效成分对Hela等细胞有强烈的抑制作用。

在百慕大西洋群岛的研究中，发现拟杆菌门的SAR202在可见光海域分布较多，而在海底不可见光海域非常稀少，通过对不同的海域和不同的海水进行分析比对证实了海洋微生物群体的多样性。运用用宏基因组技术分析珊瑚，发现其含有38%的真菌序列，其他序列包括7%细菌、1%古生菌、2%真核病毒以及3%噬菌体。相信，利用宏基因组技术开发研究更多的不可培养海洋微生物。

1.2 宏基因组学概述

宏基因组，最初是由Handelsman等于1998年提出的，即一个环境中的全部微生物基因组信息。宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组作为研究对象，用功能基因筛选或测序分析的手段研究包括不可培养微生物在内的方法。宏基因组提供了一种探知微生物多样性结构和功能基因的免培方法，是一条寻找新基因及其产物的新途径。

自然界生物之间彼此依赖，很多微生物很难在实验室条件下培养。2004年Handelsman发现宏基因组技术可以通过直接提取的方法对微生物的遗传物质进行分析。2010年Wong发现宏基因组技术可以用于研究功能基因和编码酶的基因，同时可以用于研究生物合成过程的生物活性催化剂以及次生物代谢物。2012年，Stewart将细胞培养在多孔的中空纤维膜中，运用组学技术获取生物多样性信息。

宏基因组文库的筛选方式分为功能筛选和测序筛选。功能筛选即生物活性水平的筛选，根据重组克隆产生的新活性进行功能筛选。测序筛选是通过PCR扩增从已知基因的保守片段中识别目标基因。图1为宏基因组技术操作步骤。

图1 宏基因组技术操作步骤

2 宏基因组学在海洋微生物中的研究进展

2.1 宏基因组学在海洋微生物新型酶方面的研究

为适应海洋中各种极端环境，某些海洋微生物经演化生成了特殊的代谢产物，可利用宏基因组技术研究新型酶。2012年Cipolla等和Karan等发现嗜冷酶在所有极端酶中具有一定代表性，相比其他常温酶以及嗜热酶，嗜冷酶的活性相较之高出10倍多。2013年Fu等在北极潮间带利用宏基因组文库筛选分离出Est97的新型嗜冷酯酶，此酶可用于低温生物转化。2012年Lee等首次在朝鲜西海岸利用宏基因组文库分离出具有脂肪酶活性的磷脂酶A。2012年Fang和他的研究团队从细菌中发现了一种碱性的新型漆酶，该酶可以通过添加含氯化合物增加这种酶的碱性。2012年韩国团队Jeon等通过宏基因组学发现耐盐酯酶属于一种新的酶家族。2013年Wierzbicka-Wos等在波罗的海利用宏基因组文库筛选BglMKg酶，此酶有β-半乳糖苷酶、β-岩藻糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。Zhu以及他的团队于2013年在海洋中发现了解脂酶；2013年Mohamed等从红海的宏基因组文库中提取出一种新型酯酶，这种新型酯酶结合了嗜热活性和抵抗重金属的能力，可以将其应用到生物修复中。Schroder等于2014年发现了β-葡萄糖苷酶。同时，Schroder等还提取出了具有耐盐能力的酶。此外， Sayed等于2014年从红海的样品中提取一种新型汞还原性酶，它在高温、高盐和重金属条件下有很强的催化能力。

2.2 宏基因组在海洋微生物代谢产物方面的研究

海洋可以称之为含有大量天然产物的“容器”，这些天然产物很大有药用价值。2011年Imhoff等发现海洋微生物在不断繁衍进化的过程中可以产生具有特殊生物活性的次级代谢产物。此外，Asolkar等于2009年、Sakurada等于2010年、Mayer等于2013年分别发现了这些代谢产物对于治疗心血管疾病、免疫缺陷以及神经系统疾病有帮助。宏基因组技术对于探索难分离和培养的海洋细菌中的生物活性化合物十分有利。

2.3 宏基因组在筛选海洋微生物化合物方面的研究

2.3.1 测序筛选海洋微生物化合物方面的研究

Piel和他的团队首次在海绵生物上应用焦磷酸测序技术，提取出非核糖体肽和聚酮合酶基因簇，发现了聚酮类产物(胆酸脂和异戊烯酮)具有抗肿瘤活性，该基因簇由于内含子的缺失和SD序列的存在可以和细菌形成共生体。2004年和2007年Haygood研究团队运用宏基因组学技术证实了聚酮类物质在pks基因簇中的存在。

一直以来，基因组学的不断进步为宏基因组技术提供了新策略。单细胞基因组学可以降低宏基因组学的复杂性。2007年Kvist等从复杂的微生物群体中分离出单细胞，再通过测序或 PCR筛选扩增其基因组。2011年Grindberg等利用宏基因组筛选技术分离apr基因簇，这是一种含有抗肿瘤环脂肽Apratoxin A.天然产物的物质。

2.3.2 功能筛选海洋微生物化合物方面的研究

功能驱动筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从宏基因组文库中获得特殊功能的克隆。主要方法有2种：一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上的表型特征进行筛选，这种方法灵敏度高，较少的目标克隆也能被检测到；另一种是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行筛选。功能筛选的优点是不需要生物合成过程中初始化合物的信息。

尽管功能筛选有许多成功的实验，可仍然存在不足，因为很多基因在异源宿主不能表达。但2012年Ekkers等用链霉菌、假单胞杆菌和芽孢杆菌形成的细菌链解决了这类问题。此外，阳性克隆子可以通过快速的筛选技术分析大量样品，Ballestriero等于2010年和Owen等于2012年发现了新的筛选技术，2013年Penesyan等对其方法进行改善，提高其筛选的效率，对未来的功能筛选技术作出贡献。

2.4 宏基因组学在海洋微生物石油修复方面的研究

一直以来，常用微生物降解石油烃进行海洋石油污染修复，对比其他方法有着无可比拟的优越性。但有些海洋微生物处于极端环境，并且海洋环境中可培养的微生物仅占0.001%～0.1%。宏基因组技术无需培养微生物，可直接从环境中提取微生物的基因组，筛选出低温环境中活性较高的微生物及新活性物质。因此，宏基因组学在海洋微生物石油修复中有很好的应用前景。2019年Luciana R.Appolinario、DiogoTschoeke、Raphael V.S.Paixão等在南太平洋利用宏基因组学技术发现了降解石油的微生物的代谢物质。

此外，宏基因组学技术若与其他技术相结合还可以更好地提升海洋石油污染生物修复的效果。总之，宏基因组学可以用于开发新功能的海洋微生物和基因，从而运用于海洋石油污染治理，有十分大的开发潜力。

3 展望

无论是对海洋环境中微生物多样性的研究，还是发现新型生物活性催化剂或活性化合物的研究，宏基因组技术都可以在这些方面有广泛的应用前景。由于宏基因组学技术操作简便，培养技术相对于传统基因组学培养技术更先进，该技术在测序以及生物信息学分析上有更大的进步空间。

此外， 宏基因组技术在生物资源研究方面有很明显的优势，但是由于该技术还不够成熟，仍然有一些问题需要解决，如：如何高效提取DNA、如何选择更高效的提取载体以及筛选的方法。因为宏基因组学涉及领域十分广泛，我们可以将现代分子技术、计算机技术以及生物信息学与宏基因组技术相融合，在各个领域获得更广泛的应用。

宏基因组技术在国内外已经有如此广泛的应用前景，因此各国在海洋生态系统建设方面也都有一定的贡献。许多实验项目正在进行当中，主要针对于从极端环境中提取新型海洋微生物，发现一些新型产物，并在健康、医疗、保健等方面有一定突破。目前，研究人员在海洋微生物方面的研究有卓越贡献，并得到了各国政府的大力支持。