补肾助孕方对肾虚薄型子宫内膜大鼠内膜容受性的影响及机制研究

杨斌 周文清 陈莎 郭宇洁 谢京红

摘要 目的：觀察补肾助孕方对肾虚薄型大鼠子宫内膜容受性的影响，探讨中药的作用机制。方法：雌性SD大鼠30只，随机分为对照组10只，造模组20只，通过羟基脲灌胃建立肾虚合并着床障碍型子宫内膜大鼠模型。随后将20只造模组大鼠随机分为模型组和补肾助孕方组，每组10只。对照组、模型组均灌服蒸馏水10 mL/kg;补肾助孕方组灌服中药0.3 mg/kg，均1次/d，持续3个动情周期（15 d）。在第3个动情期后处死大鼠，酶联免疫吸附法检测动脉血中雌二醇、孕酮的水平。取子宫标本，光镜下观察子宫内膜形态，测量子宫内膜厚度、子宫间质厚度、子宫腺体数、子宫血管数。免疫组化法检测各组内膜组织中整合素β3和白血病抑制因子的表达。结果：与正常对照组比较，模型组大鼠动脉血雌二醇、孕酮的水平减少;子宫内膜腺体稀少，上皮变薄，间质致密，血管少;子宫内膜厚度、子宫间质厚度、子宫腺体数、子宫血管数均减少;整合素β3和白血病抑制因子的表达减少。补肾助孕方组较之模型组，有明显的改善。结论：补肾助孕方可改善肾虚合并着床障碍型状态大鼠子宫内膜的容受性，可能与提高血中激素水平，增加内膜中整合素aβ3和白血病抑制因子的表达有关。

关键词 补肾助孕方;子宫内膜容受性;子宫内膜形态;整合素β3;白血病抑制因子

Abstract Objective：To observe the effects of Bushen Zhuyun Formula on the endometrial receptivity of rat model with kidney deficiency and thinner endometrial， for exploring the possible mechanism of the Chinese medicine. Methods：A total of 30 female SD rats were randomly divided into a control group （10 rats） and a model group （20 rats）. Rats model with kidney deficiency and embryo implantation dysfunction were established by intragastric administration of hydroxyurea. Then 20 rats in the modeling group were randomized into a model group， Bushen Zhuyun group with 10 in each.The control group and the model group was given oral administration of distilled water 10 ml/kg; the Bushen Zhuyun Formula group was given Chinese medicine 0.3 mg/kg， respectively. All these rats were intervened once daily， and the intervention lasted for 3 consecutive estrous cycles （15 days）. Rats were sacrificed after the third estrus period. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of estradiol and progesterone in arterial blood. Take a specimen of the uterus， observe the morphology of the endometrium under a light microscope， measure the thickness of the endometrium， the thickness of the interstitium， the number of uterine glands， and the number of uterine blood vessels. Immunohistochemical method was used to detect the expression of integrin β3 and leukemia inhibitory factor in the inner membrane tissue of each group. Results：Compared with the normal control group， the arterial blood estradiol and progesterone levels of rats in the model group were reduced; the endometrial glands were sparse， the epithelium became thin， the interstitium was dense， and the blood vessels were less; the thickness of the endometrium， the thickness of the interstitium， the number of uterine glands and uterine blood vessels decreased; the expression of integrin β3 and leukemia inhibitory factor decreased. Compared with the model group， the Bushen Zhuyun Formula group has obvious improvement. Conclusion：Bushen Zhuyun Formula can improve the endometrial receptivity of rat model with kidney deficiency and embryo implantation dysfunction， and the mechanism is related to increasing hormone levels in the serum and ？increasing the expressions of integirn β3 and leukemia inhibitory factor （LIF） in the endometrium.

Keywords Bushen Zhuyun Formula; Endometrial receptivity; Endometrial morphology; Integrin β3; Leukemia inhibitory factor

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.009

复发性流产（Recurrent Spontaneous Abortion， RSA）是指与同一性伴侣在孕20周以内连续发生2次及2次以上的自然流产，发病率约占育龄期妇女的5%[1]，再发生风险高达70%～80%[2]。RSA发病机制多样，可能的因素包括遗传、解剖、感染、内分泌因素等等[1]，子宫内膜容受性（ER）异常也是引起RSA发生的高危因素之一[3]。子宫内膜容受性差是指子宫内膜对胚胎定位、黏附、侵入的接受能力低，可以直接导致胚胎的植入失败[4]。因此，改善子宫内膜容受性亦是降低RSA复发风险的有效措施。补肾助孕方是国医名师蔡连香主任治疗复发性流产、不孕症等的经验方，临床应用效果显著，可明显降低复发性流产的再发生率，机制可能与子宫内膜厚度增加，内膜容受性得到改善有关[5-6]。本研究拟观察补肾助孕方对肾虚复发性流产大鼠子宫内膜容受性及其影响因素的作用，研究中药对复发性流产的防治机制，并探索补肾助孕方对子宫内膜容受性的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠30只，体质量（235±15）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0001。动物适应性饲养1周，室温20～24 ℃，湿度40%～60%。本研究已通过西苑医院伦理委员会的审核批准（伦理审批号：2018XL088）。

1.1.2 药物 1）补肾助孕方（由菟丝子30 g、太子参20 g、制龟甲20 g、续断20 g、熟地黄10 g、白术10 g、当归10 g、陈皮10 g组成），煎制成含生药量3.0 g/mL的溶液。按照大鼠体表面积换算方法，大鼠的使用剂量为0.3 mg/（kg·d）;2）羟基脲片（齐鲁制药有限公司，批号：H37021289），在蒸馏水药片溶解药片，大鼠的灌胃剂量为450 mg/（kg·d）。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠雌二醇（Estradiol，E2）、孕酮（Progesterone，P）酶聯免疫吸附测定试剂盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，货号分别为E-EL-RO348c，E-EL-RO775c）;整合素β3多克隆抗体（abcam公司，货号：ab119992，批号：79785-2）;白血病抑制因子LIF（abcam公司，货号：ab113262，批号：74231-1）;酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（中杉金桥生物科技有限公司，货号PV6000，批号1919D0516）;显微镜（Olympus公司，型号：BX51）;图像处理软件（Media Cybernetics公司，型号：Image-Pro Plus 6.5）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 30只雌性SD大鼠随机分为2组，正常组（10只）、造模组（20只）。阴道涂片观察月经周期，确保在非动情期开始给药。造模组大鼠采用羟基脲450 mg/（kg·d）连续灌胃9 d（约为2个动情周期），当大鼠出现进食、运动减少，体质量下降，毛发枯槁欠光泽以及大便糖稀时，表明肾虚模型成功。随即造模组大鼠在双侧宫角处注入95%乙醇0.5 mL，保持宫腔充盈状态5 min后，生理盐水反复冲洗宫腔后关腹，构造薄型子宫内膜大鼠模型。待内膜组织取材、固定、HE染色后，显微镜下观察内膜组织形态，确认薄型内膜模型是否成功。

1.2.2 干预方法 造模结束后，造模组随机分为模型组，中药组，每组10只。正常组及模型组给予蒸馏水10 mL/（kg·d）灌胃，中药组按大鼠体表面积系数法计算，给予补肾助孕方剂量0.3 mg/（kg·d）灌胃，干预周期为3个动情周期，约为15 d，观察阴道涂片，在动情期处死各组大鼠，取血并取出子宫，称重后部分放入10%中性福尔马林液中固定，部分-80°C冰箱冻存。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清E2、P水平 水合氯醛麻醉大鼠，分离一侧颈总动脉，动脉取血5 mL，3 000 r/min，离心半径8 cm，离心10 min，取上层血清保存于-80 ℃冰箱备用。应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠E2、P的水平。

1.3.2 各组大鼠子宫内膜组织学观察 宫内膜组织在10%的中性福尔马林液固定36 h，取材，自动脱水机脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规切片，厚度4 μm，苏木素-伊红（HE）染色，在光镜下观察宫内膜组织形态学变化。

1.3.3 测量子宫内膜被覆上皮的厚度、子宫内膜厚度、子宫间质厚度、子宫腺体数、子宫血管数 在中倍（×200）下找到子内膜被覆上皮最厚的区域，采用Image-Pro Plus 6.0图形图像分析系统测量子宫基底膜到宫腔的垂直距离，每只大鼠计数5个视野，平均值表示该只大鼠子宫内膜被覆上皮的厚度。统计子宫内膜腺体及血管数目，同样采用中倍下5个视野的平均值方法来操作。

1.3.4 免疫组化法检测整合素β3及白血病抑制因子的蛋白表达情况 切厚度4 μm白片，70 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，3%的双氧水避光10 min灭活内源性酶，pH值6.0枸橼酸盐修复液高压热修复3 min，在切片上滴加兔抗整合素β3和LIF抗体（浓度均为1∶100），4 ℃冰箱孵育过夜;次日复温并PBS水洗后，滴加PV 6000通用型二抗，常温孵育30 min，PBS水洗后，DAB显色，在镜下根据目标蛋白的着色控制反应时间，自来水洗终止反应，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片。两目标蛋白的阳性信号均为胞质内呈现棕黄色颗粒，光镜高倍镜下（×400）每张切片随机取5个视野，用Image-Pro Plus 6.5软件测定目标蛋白在子宫内膜上的阳性信号积分光密度（IOD）值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠血清内性激素水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清血清中E2和P明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05）;中药组较模型组血清中E2和P明显升高（P<0.05）;中药组与空白对照组之间比较，E2和P均为轻度减低。可见补肾助孕方能有效调节模型大鼠性激素水平，使得E2和P水平上升。见表1。

2.2 各组大鼠子宫内膜组织形态学变化 光镜观察发现：正常对照组大鼠子宫内膜腺体密集，腺管增生、扩张迂曲，上皮细胞呈高柱状，管腔内可见分泌，间质细胞排列疏松，间质细胞大、水肿，蜕膜样变，血管增多;模型组大鼠子宫内膜腺体稀少，腺腔较直并且狭小，腺上皮细胞呈立方状，间质细胞变小变少，血管数量减少;中药组大鼠子宫内膜腺体增多，腺体较迂曲，管腔扩张，分泌物增多，间质轻度疏松、水肿，血管轻度增生。见图1。

2.3 各组大鼠子宫内膜组织形态学指标测量 与空白对照组比较，模型组大鼠子宫内膜厚度、间质厚度以及腺体、血管数目均有明显的减低，差异有统计学意义;与模型组比较，中药组在上述指标均有不同程度的提升，差异有统计学意义。这些形态学指标都是属于衡量子宫内膜容受性的“金指标”，说明中药补肾助孕方能够有效的提高大鼠子宫内膜的容受性，发挥促进胚胎种植，增加妊娠机率的作用。见表2。

2.4 各组大鼠子宫内膜整合素β3及白血病抑制因子的表达 免疫组化结果表明，各组大鼠子宫内膜组织内整合素β3及白血病抑制因子均有不同程度的表达，表达部位在腺上皮细胞及部分间质细胞的胞质。组化结果显示：与正常对照组比较，模型组2目标蛋白表达水平均呈明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。中药组较模型组，表达呈显著增加，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见图2。

3 讨论

复发性流产是目前妇科领域备受关注的疑难病症之一，本病在我国的发病率呈增长趋势。针对目前现代医学治疗本病临床疗效欠佳的难题，发挥中医药在增加子宫内膜厚度改善子宫内膜容受性的优势，为临床提供有效安全的药物，防止自然流产的反复发生是很有意义的。

除了需要發育良好的胚泡外，容受性高的子宫内膜是成功胚胎种植必要条件。正常情况下，子宫内膜在雌孕激素的作用下发生一系列形态结构改变，这种变化是与胚泡发育同步，配合胚泡着床。包括内膜增厚，腺体增生、分泌旺盛，间质细胞增多、蜕膜样变，血液供应丰富，构成良好的着床微环境，使胚泡顺利着床。反之，若子宫内膜发育较迟缓，出现诸如内膜变薄，腺体稀疏，间质细胞小而紧密，血运较差等形态变化时，则胚泡难以着床导致致流产或不孕[8]。由于子宫内膜容受性是个动态的变化过程，尽管与雌激素、孕激素水平的变化密切相关，但对于子宫内膜容受性改变做一准确评估，目前尚无比较明确、统一的临床诊断标准。有研究者发现，某些蛋白的表达高低与子宫内膜种植窗时期的状态相关，因而可以被临床作为预测子宫内膜容受性高低的标志分子[9]。其中，最为关键的2个蛋白分子即为整合素β3和白细胞抑制因子（LIF）。整合素β3属于细胞黏附分子，为Ca2+通道跨膜受体，表达在子宫内膜上皮及腺体细胞膜上，介导细胞内外信号的传递。随着月经周期的改变其表达出现升降变化，高表达的时限与“种植窗”的开启的时间相一致[10]。LIF属于白细胞介素6家族分子，是一种分泌型糖蛋白配体，与相应的受体结合后在细胞生长、增殖和分化中发挥广泛的作用[11]。临床研究发现：正常LIF的表达量具有时效性，随着月经周期的变化而变化;处于分泌期的子宫内膜LIF的mRNA转录表达量呈上升趋势，在晚期时可达到峰值，而间期的转录量处于峰底。RSA患者及正常对照的蜕膜测定发现，前者的的LIFmRNA浓度明显低于其对照组[12]。有实验证明，小鼠在LIF基因敲除后，胚胎种植不能发生，而将外源性的LIF基因给予敲除小鼠，或者将基因敲除小鼠的胚胎种植在其他正常小鼠，两者均可使胚胎正常种植[13]。

我们吸纳前人“治未病”“预培其损”观点，提出“培补养胎之源，孕前干预”是治疗本病的关键，肾精为胚胎的先天之源，若母体禀赋不足，房劳多产，多次胎停育，可伤及冲任、胞宫，从而伤及肾中精气，使胎失所固，肾虚是发病之本。同时，脾为胚胎的后天之源，若脾胃虚弱，气血亏虚，胎失所养。根据首都国医名师蔡连香教授的经验，创制了滋补肾精、益气健脾的补肾助孕方。药物组成：君药：菟丝子：归肝、肾、脾经，补肾益精、养肝明目;太子参：归脾、肺经，补气，健脾、生津润肺。臣药：炙龟甲：归肾、肝、心经，滋阴潜阳、益肾健骨、养血补心;熟地黄：归肝、肾经，补血养阴、填精益髓;续断：归肝、肾经，补益肝肾、强筋健骨、止血安胎;白术：归脾、胃经，健脾益气，益肾固精。佐使药：当归：归肝、心、脾经，补血调经、活血止痛;陈皮：归脾、肺经，理气健脾、燥湿化痰。全方共奏：补肾填精，健脾养血。使用该方孕前干预治疗复发性流产的临床疗效观察结果显示：可以有效改善患者再次妊娠后妊娠结局，并可提高孕后保胎的成功率，已产胎儿健康[14-15]。

本次研究结果证实，补肾助孕方能够提高肾虚胚胎着床障碍大鼠的子宫内膜容受性，从而达到预防流产、增加妊娠率的目的。首先对于形态学的观察和测量，发现模型组表现为大鼠子宫内膜腺体稀少，腺腔分泌功能减低，间质小而致密，内膜薄、腺体数、血管数目均减少，都表明内膜容受性差，不利于胚胎植入。而在给予助孕方中药干预后，镜下发现子宫内膜厚度增加，腺体增多，间质疏松呈蜕膜样改变，血管数目亦增加，说明中药能明显通过提高内膜容受性，改善种植窗子宫内膜，促进妊娠的发生。其次，在机制研究中我们发现，模型组中血清中雌二醇、孕酮的水平均显著下调，而中药组有明显提升，提示二者协调表达可作为子宫内膜容受性的客观标志，整合素β3及白血病抑制因子在模型组大鼠子宫内膜上的蛋白表达均下调，而补肾助孕方能够显著，改善子宫内膜组织形态，潜在机制或与升高整合素β3及白血病抑制因子的蛋白表达有关。

综上所述，补肾助孕增方可以增加肾虚薄型子宫内膜大鼠种植窗口期子宫内膜组织中整合素β3及白血病抑制因子的表达，进一步改善子宫内膜的组织形态，提升雌孕激素水平表达。从而通过提高子宫内膜容受性，降低流产率，提高妊娠率。

参考文献

[1]乐杰.妇产科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2007：83，391.

[2]林其德.自然流产[M].北京：人民卫生出版社，2015：249.

[3]Würfel W.Treatment with granulocyte colony-stimulating factor in patients with repetitive implantation failures and/or recurrent spontaneous abortions[J].J Reprod Immunol，2015，108：123-135.

[4]Makker A，Singh MM.Endometrial receptivity：clinical assessment in relation to fertility，infertility，and antifertility[J].Med Res Rev，2006，26（6）：699-746.

[5]夏譽薇，张树成，蔡连香.女贞孕育汤对不孕症子宫内膜组织形态、雌孕激素受体和血管生成因子表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2004，11（1）：26-28.

[6]张树成，陈秋梅，夏誉薇，等.补肾助孕方药促进入子宫内膜血管生成的实验研究[J].中医药学刊，2004，22（5）：820-822.

[7]Achache H，Revel A.Endometrial receptivity markers，the journey to successful embryo implantation[J].Hum Reprod Update，2006，12（6）：731-746.

[8]Valdes CT，Schutt A，Simon C.Implantation failure of endometrial origin：it is not pathology，but our failure to synchronize the developing embryo with a receptive endometrium[J].Fertil Steril，2017，108（1）：15-18.

[9]Craciunas L，Gallos I，Chu J，et al.Conventional and modern markers of endometrial receptivity：a systematic review and meta-analysis[J].Hum Reprod Update，2019，25（2）：202-223.

[10]Zhao H，Sui L，Miao K，et al.Comparative analysis between endometrial proteomes of pregnant and non-pregnant ewes during the peri-implantation period[J].J Anim Sci Biotechnol，2015，6（1）：18.

[11]Salleh N，Giribabu N.Leukemia inhibitory factor：roles in embryo implantation and in nonhormonal contraception[J].ScientificWorldJournal，2014，2014：201514.

[12]郭晓霞，张春平，陈廉.复发性自然流产患者子宫蜕膜及绒毛组织白血病抑制因子基因表达的研究[J].实用妇产科杂志，2004，20（4）：238-239.

[13]Winship A，Correia J，Krishnan T，et al.Blocking Endogenous Leukemia Inhibitory Factor During Placental Development in Mice Leads to Abnormal Placentation and Pregnancy Loss[J].Sci Rep，2015，5：13237.

[14]谢京红.补肾助孕法孕前干预与孕后保胎序贯治疗的临床研究[D].北京：中国中医科学院，2014.

[15]谢京红，张瑶，韩冉.补肾安胎方配合黄体酮治疗复发性流产的临床观察[J].世界中西医结合杂志，2013，8（10）：1016-1018，1021.

（2019-10-17收稿 责任编辑：王明）