miR-155及IL-35在哮喘患者外周血中的表达及其潜在临床意义

黄琰 邹雯 谢林艳 郑蓉蓉 王一江

资料与方法

一、一般资料

前瞻性的选取2016年1月至2018年12月期间我院收治的哮喘病患者62名为观察组，同期选取于我院体检的健康者62名作为对照组。入选标准：1)哮喘患者的诊断符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘指南标准；2)患者年龄18～70周岁；3)哮喘病程大于10年者；4)近四周内未使用糖皮质激素(包括吸入类糖皮质激素)或者免疫抑制剂者；排除标准：1)合并肝肾功能不全者；2)合并免疫系统疾病者；3)哮喘合并其它肺部疾病如COPD者；4)存在其它组织器官感染需抗感染治疗者；5)凝血功能障碍者；6)既往存在肺部外伤或者手术者；7)哮喘急性加重期或哮喘持续期。两组患者均对此研究知情并签署同意书，本研究经本院伦理委员会批准通过。

二、研究方法

1 研究对象外周血的抽取 获取两组研究对象空腹时晨外周静脉血，量约6～8 mL，置抗凝管中，然后放入离心机，以3000r/分的速度离心，离心10 min，分离上清液，然后将上清液放入-80℃保存备用。

2 miR-155含量检测 采用实时定量PCR检测两组研究对象外周血中miR-155含量水平，使用用Trizol 试剂从上述样本中抽提总RNA，用紫外分光光度计测总RNA含量，A260 /A280值在1.8～2.0之间提示标本方可用。然后对总RNA 进行电泳，反转录为单链cDNA。最后在荧光定量PCR仪上分别对miRNA-155和U6进行扩增。采用2-△△Ct计算miRNA-155 的相对表达量。

3 IL-35、IL-4及IL-6的监测方法 应用酶联免疫吸附法试剂盒(酶联免疫分析仪：Infinite F50,帝肯公司，瑞士；试剂盒，Santa公司 美国)检测IL-35、IL-4和IL-6的血清含量，具体操作方法按照试剂盒的方法操作。

三、数据统计

结 果

一、两组研究对象一般资料比较

本研究结果显示，两组研究对象在年龄、性别、高血压、糖尿病等方面无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

表1 两组研究对象资料比较

二、两组研究对象血清miR-155与IL-35水平比较

本研究结果显示，观察组患者血清miR-155高于对照组患者，而血清IL-35的含量则显著低于对照组患者(P<0.05)，在一定程度上说明了miR-155与IL-35参与了哮喘病的发生发展(见表2)。

表2 两组研究对象血清miR-155与IL-35水平比较

三、 两组患者研究对象血清IL-4及IL-6水平比较

本研究结果显示，观察组患者血清IL-4及IL-6含量水平则显著高于对照组患者(P<0.05)，在一定程度上说明了哮喘患者血清IL-4与IL-6水平高于健康体检者，说明炎症因子参与了哮喘病的发生及发展(见表3)。

表3 两组研究对象血清IL-4与IL-6水平比较

四、miR-155表达水平与炎症因子IL-35之间以及IL-35与IL-4和IL-6的相关性

本研究结果显示，哮喘病患者血清miR-155与IL-35的含量呈负向相关，同时IL-35与IL-4和IL-6呈负性相关性(P<0.05)，说明了miR-155通过影响IL-35、IL-6及IL-4的表达水平参与哮喘病的发生发展(见表4)。

表4 IL-35与miR-155、IL-4及IL-6相关性分析

五、哮喘病患者发生的单因素及多因素Logistic回归分析

本研究对本组哮喘病的发生进行单因素分析时发现，既往个人过敏史、家属过敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平是哮喘病发生的危险因素(见表5)。 多因素Logistic回归分析结果显示，个人过敏史、家属过敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平血清miR-155升高及IL-35水平含量下降是哮喘病发生的独立危险因素(见表6，表5)。

表5 哮喘病发生单因素分析

表6 哮喘病多因素 logisitic 回归分析结果

讨 论

哮喘病临床特点包括发作性气道平滑肌痉挛而导致气道高张力，从而产生呼吸困难及并发气道感染的风险[11]。目前缓解临床气道痉挛、激素类药物等对症治疗是该疾病的主要治疗方法，但如何从分子甚至是基因的研究，是目前哮喘病研究的重点[12]。

miR-155作为最近的研究重点，其本身作为一种多功能的RNA，主要参与免疫系统的构建。目前证实免疫系统紊乱及其炎症反应是哮喘病发生的主要病因，前者包括Th1(细胞免疫应答)/Th2(分泌细胞因子介导体液免疫)失平衡，后者则包括IL-35的低表达及IL-4与IL-6因子的异常表达，且两者之间也存在密切相关性[13]。故miR-155及IL-35的含量表达对研究哮喘的发生发展具有重要临床意义。

本研究结果显示，哮喘组患者血清miR-155的含量明显高于健康者，而IL-35的含量低于对照组患者，其可能机制如下：miR-155通过限制IL-35的表达打破了Th1/Th2的平衡，促进了Th2的活性，进一步产生了IL-4及IL-6等炎症因子的过度表达，最后对气道产生了损伤，诱发支气管哮喘的发生，而本研究结果也显示了观察患者炎症因子IL-4及IL-6的表达高于对照组研究对象，初步证实了miR-155/IL-35途径参与了哮喘的发生发展，与既往的研究结果一致[14]。

研究证实IL-35作为哮喘病免疫的第一反应因子，其由T淋巴细胞分泌的IL-12家族成员，可通过影响Th2从而改变细胞因子的分泌(IL-4及IL-6)最终参与哮喘发生发展的过程。本研究结果显示IL-35与IL-4及IL-6存在负向相关性，可见IL-35具有可抑制IL-4及IL-6量的表达，从而调控体液免疫，减少组胺类及炎性物质的释放，最终缓解临床症状的潜在可能，既往存在类似的报道[15-16]。

本研究结果进一步分析显示miR-155与IL-35的表达出在负性相关关系，同时Logistic分析显示miR-155水平升高及IL-35降低是哮喘发生的独立危险因素，在一定程度上提示了miR-155在一定程度上限制了IL-35的表达，但具体生物学途径的通路轴，对我们进一步理解miR-155参与哮喘病的发生发展机理是十分必要的。

综上所述，miR-155通过影响炎症反应及炎症因子IL-35、IL-4及IL-6参与了哮喘的病理生理过程，具有重要的临床研究意义。但本研究为单中心研究且样本量少，需要多中心大样本的研究进一步验证。