嗜酸性粒细胞来源神经毒素与儿童呼吸道感染喘息症状相关性研究

朱敏 俞玲玲 杨晓京 黄蕴 闻建军

众所周知，多种类型血细胞与哮喘发作相关，多个研究也显示，支气管哮喘患者气道黏膜内嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润和激活显著增加，肺泡灌洗液、痰液和外周血中嗜酸性粒细胞计数显著增加，部分患者还可出现中性粒细胞计数增加[1-2]。嗜酸性粒细胞和中性粒细胞内含有大量具有生物活性的介质，这些介质被释放后可迅速诱导炎症反应发生[3]，其中嗜酸性粒细胞是哮喘的特征性细胞之一，活化的嗜酸性粒细胞可进一步导致气道上皮细胞损伤和气道痉挛[4]，但目前对于嗜酸性粒细胞激活的检测尚缺乏特异性的生物标志物[5]。

嗜酸性颗粒是黏附于细胞膜上的颗粒样物质，其内含有大量正电荷的蛋白质类物质，可诱导组织损伤[6]。主要碱性蛋白(major basic protein，MBP)位于嗜酸性颗粒的核心，而嗜酸性[7]阳离子蛋白(eosinophilic cationic protein，ECP)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(eosinophil peroxidase，EPX)和嗜酸性粒细胞来源神经毒素(eosinophil-derived neurotoxin，EDN)存在于颗粒的基质中[8]。在这些颗粒蛋白中，EDN作为一种哮喘诊断和动态监测的生物标志物在多种超敏反应相关疾病中均有一定研究，如毛细支气管炎后儿童反复喘息、儿童哮喘、过敏性鼻炎和气管炎后慢性咳嗽等[9]。既往的研究显示，外周血中嗜酸性粒细胞计数和百分比并不能精确反应患者嗜酸性粒细胞激活状况，而外周血EDN和ECP水平与嗜酸性粒细胞激活显著相关[10-11]。本研究旨在探索外周血EDN水平与呼吸道感染儿童喘息症状的相关性，为临床诊断提供新的依据。

资料与方法

一、研究对象

本研究回顾性纳入了2016年1月至2019年6月之间就诊于我院的120例呼吸道感染的儿童。纳入标准为：1)年龄≤7岁；2)可获取完整病历记录。排除标准：1)既往有明确支气管哮喘病史；2)合并有先天性心脏病等病史。

所有患者就诊时均经首诊医师完成查体，若听诊闻及喘息或高调性干啰音，则定义为喘息组，但湿啰音并不定义为喘息。

二、信息采集

本研究通过电子病历系统获取患者一般临床信息和检查结果，包括年龄、性别、过敏史、父亲/母亲过敏史、过敏性皮炎病史、宠物接触史、呼吸道感染类型、尘螨特异性IgE检测结果等。

三、EDN检测

血浆EDN检测采用EDN酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)试剂盒(韩国SKIMS-BIO公司)完成[12]，操作按照说明书推荐流程进行，最终采用分光光度计完成检测。患者外周血血浆经离心分离后保存于-80℃冰箱内，经溶解后完成本次检测。

四、统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0软件完成。满足正态分布和方差齐的两组间比较，采用t检验的方法,不满足正态分布或方差不齐的喘息组和非喘息组患者的EDN比较采用Mann-Whitney检验，进一步将非喘息组患者分为肺炎组、普通上呼吸道感染、扁桃体炎三组，四组间EDN组间比较采用Kruskal-Wallis检验,四组之间两两比较采用P值修正的方法。分类变量采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验比较组间差异。本研究以双侧检验P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料

本研究共纳入120例呼吸系统感染患者，其中喘息组40名、非喘息组80名(见表1)。喘息组患者平均年龄显著高于非喘息组患者(P<0.001)，并且喘息组患者过敏性皮炎病史比例显著高于非喘息组患者(P=0.042)，两组患者在性别、食物过敏史、父亲/母亲过敏史、宠物接触史和尘螨特异性IgE阳性患者比例方面无显著统计学差异。

表1 患者一般信息比较

二、喘息组与非喘息组患者外周血EDN比较

喘息组患者EDN为48.8± 71.4 ng/mL，而非喘息组患者EDN为13.3±5.1 ng/mL(见图1)，喘息组患者外周血EDN水平显著高于非喘息组患者(Z=3.141，P<0.001)。

图1 喘息组与非喘息组患者EDN比较

三、外周血EDN与年龄和疾病类型关系

将喘息组患者和非喘息组患者分为<1岁、1～3岁和3～7岁三组(见图2)。无论是喘息组患者和非喘息组患者，不同年龄组患者外周血EDN水平均无显著统计学差异。此外，将非喘息组患者进一步分为肺炎、普通上呼吸道感染和扁桃体炎组(见如图3)，喘息组患者外周血EDN水平显著高于肺炎(P<0.001)、普通上呼吸道感染(P<0.001)和扁桃体炎(P<0.001)患者，但肺炎、普通上呼吸道感染和扁桃体炎三组之间则差异无显著统计学意义。

图2 不同年龄组患者END比较A：喘息组患者(无小于1岁患者)；B：非喘息组患者

图3 不同疾病类型患者EDN比较

讨 论

本研究检测了120例呼吸道感染的7岁以内儿童外周血END，结果显示喘息组患者血浆EDN水平显著高于非喘息组患者，进一步将非喘息组患者分为肺炎、普通上呼吸道感染和扁桃体炎，结果显示喘息组患者血浆EDN均显著高于次3个亚组，肺炎、普通上呼吸道感染和扁桃体炎患者之间血浆EDN无显著统计学差异，同时不同年龄组之间血浆EDN无显著差异。

嗜酸性粒细胞在哮喘患者过敏性气道炎症反应中起重要作用[13]。既往的研究显示，嗜酸性粒细胞参与哮喘患者免疫反应、气道高反应性和气道重塑的变化[14]。在呼吸道感染后反复喘息患者中，病原体感染和超敏反应相关炎性反应，可导致嗜酸性粒细胞激活，激活的嗜酸性粒细胞可释放包括ECP、EDN等多种脱颗粒蛋白[15-16]。与ECP等脱颗粒蛋白相比，EDN的电荷弱，故与细胞内膜结构的粘附力很弱，并且与检测过程中所用耗材和容器壁的粘附也更弱，因此更易于通过实验检出[17]，是较为理想的生物标志物选择。

多项研究显示，外周血EDN水平与哮喘患者或反复喘息患者的疾病严重程度相关，Kim等人的研究显示，呼吸道合胞病毒感染相关毛细支气管炎患者中，感染后喘息症状的患者血浆EDN水平显著升高[18]。Gon等人的研究显示，在成年哮喘患者中，外周血EDN水平与患者一秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second，FEV1)显著相关，但外周血嗜酸性粒细胞计数与FEV1则无显著相关性[19]，Badar等人的研究也显示，外周血EDN水平与哮喘患者FEV1和FEV1/FVC显著相关[20]。尽管目前尚不清楚EDN在支气管炎、哮喘发作、气道高反应和气道重塑中的分子机制，但这些结果提示EDN可能是比嗜酸性粒细胞计数更为敏感和可靠的反应嗜酸性粒细胞相关炎症反应和气道狭窄状况的指标。呼吸系统感染相关喘息是临床常见的儿科疾病之一，但目前关于其早期诊断和预测，尚缺乏有效手段，我们的研究显示，呼吸道感染相关喘息患者EDN水平显著高于非喘息患者，这提示此类患者可能伴有明显的嗜酸性粒细胞激活和嗜酸性粒细胞气道炎症。进一步不同亚组分析结果显示，EDN水平与患者年龄和呼吸系统感染的疾病类型之间无显著相关性。但本研究同样表明，喘息组患者合并过敏性皮炎的比例明显升高，这提示此类患者可能伴随全身嗜酸性粒细胞高敏状态，而感染后嗜酸性粒细胞激活和喘息症状可能只是其全身表现的其中一个部分[21]。

综上所述，本研究显示喘息型呼吸系统感染儿童血浆EDN水平显著升高，EDN可能是评估呼吸道感染儿童喘息症状的可靠生物标志物之一。