正交法优化肾茶提取工艺和滴丸制剂工艺

黄天卓，丁薇娜，张琳杰，郑浩然，何鑫磊

(美伦医药集团有限公司，天津 北辰 300403)

肾茶(Clerodendranthus spicatus (Thunb.) C. Y. Wu)又称猫须草、猫须公、肾草，是唇形科，肾茶属多年生草本植物。肾茶具有抗炎镇痛、抗菌、抗氧化、利尿的作用，其还对肝脏肾脏有一定的保护作用[1]。滴丸生物利用度高，工艺条件易于控制，质量稳定，剂量准确，受热时间短，易氧化及具挥发性度的药物溶于基质后，可增加其稳定性。目前还没有肾茶提取物的制剂，因此此研究可以填补市场上这一块的空缺，为此进行了肾茶提取工艺的优化和滴丸制剂工艺的优化。

1 实验仪器与物料

1.1 仪器

恒温水浴锅HH-6(金坛区西城新瑞仪器厂)、多功能滴丸实验机(烟台康达尔药业有限公司)、岛津液相CTO-20A(SHIMADZU CORPORATION)。

1.2 物料

肾茶20180612(河北百合中药饮片有限公司)、PEG4000 PO20190401(山东瑞生药用辅料有限公司)、PEG6000 PL20190403(山东瑞生药用辅料有限公司)、硬脂酸镁181026(陕西正一药用辅料有限公司)、硬脂酸181101(陕西正一药用辅料有限公司)、二甲基硅油20190905(江西益普生药业有限公司)、大豆油20170326(山东瑞生药用辅料有限公司)、液体石蜡171101(吉化江城油脂化工)。

2 方法与结果

2.1 肾茶提取工艺

2.1.1 肾茶的提取方案

肾茶滴丸是根据肾茶袋泡茶[2]改良而来。原工艺只用温水浸泡有效物质浸出量太低，由于检测指标为水溶性的迷迭香酸和醇溶性的熊果酸，故此研究对提取溶剂、料液比、提取温度、提取时间等单因素考察的基础上进行了L9(34)正交试验，优选肾茶滴丸的最佳提取工艺，并对结果进行验证，最后再验证最佳提取次数。

2.2 肾茶提取工艺单因素试验

2.2.1 提取溶剂

称取适量肾茶药材于具塞锥形瓶中，分别加入15倍量水、30%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，90℃下提取2h，提取两次，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，进行高效液相色谱仪检测，按内控质量标准草案项下迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算迷迭香酸百分含量；同法按内控质量标准草案项下熊果酸检测方法测定熊果酸含量，计算其中熊果酸百分含量，结果见表1。

表1 溶剂对肾茶提取工艺的影响

随着乙醇含量的增加，迷迭香酸和熊果酸含量升高，乙醇含量65%以上时，随着乙醇含量增加，迷迭香酸含量下降，熊果酸含量增加。由于迷迭香酸醇溶性不高，熊果酸不溶于水，65%乙醇提取时迷迭香酸和熊果酸总量最高，因此选择50%、65%、80%乙醇为正交试验溶剂。

2.2.2 料液比

称取适量肾茶药材于具塞锥形瓶中，分别按料液比为1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25加入65%乙醇溶液，85℃下提取2h，提取两次，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，进行高效液相色谱仪检测，进样量20μL，按内控质量标准草案项下迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算迷迭香酸百分含量；同法按质量标准草案项下熊果酸检测方法测定熊果酸含量，计算其中熊果酸百分含量，结果见表2。

表2 料液比对肾茶提取工艺的影响

随着料液比的增加，迷迭香酸及熊果酸含量逐步增加，当料液比达到1∶20时，迷迭香酸含量达到最大值，熊果酸含量也较高，而随着料液比的增加，迷迭香酸及熊果酸的含量增长缓慢。综合考虑，选择1∶15、1∶20、1∶25乙醇为正交试验料液比。

2.2.3 提取温度

表3 提取温度对肾茶滴丸提取工艺的影响

称取适量肾茶药材于具塞锥形瓶中，加入15倍量65%乙醇溶液，分别在20℃、40℃、55℃、70℃、85℃、100℃下提取，提取两次，每次2h，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，进行高效液相色谱仪检测，进样量20μL，按质量标准草案项下迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算迷迭香酸百分含量；同法按质量标准草案项下熊果酸检测方法测定熊果酸含量，计算其中熊果酸百分含量，结果见表3。

随着提取温度升高，迷迭香酸含量和熊果酸含量随之升高，迷迭香酸和熊果酸含量不断增加，在温度达到100℃后有下降趋势，推测可能是沸腾剧烈，导致部分药材贴在壁上无法被提取液浸润。综合考虑，肾茶的提取温度定为微沸温度85℃，因此不列入正交试验。

2.2.4 提取时间

称取适量肾茶药材于具塞锥形瓶中，加入15倍量65%乙醇溶液，85℃下分别提取0.5,1,1.5,2,2.5,3h，提取两次，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，进行高效液相色谱仪检测，进样量20μL，按质量标准草案项下迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算迷迭香酸百分含量；同法按质量标准草案项下熊果酸检测方法测定熊果酸含量，计算其中熊果酸百分含量，结果见表4。

表4 提取时间对肾茶滴丸提取工艺的影响

随着提取时间的增加，迷迭香酸及熊果酸含量逐步增加，提取时间达到1.5h后，含量增长减缓，而且提取时间过长也会增加成本，因此选择1h、1.5h、2h为正交试验提取时间。

2.3 肾茶提取工艺正交试验

2.3.1 正交试验设计

为了充分提取肾茶药材的主要有效成分，同时节约原材料、缩短生产周期、降低成本，对提取工艺中的乙醇浓度、料液比、提取时间用正交实验法进行优选。其因素水平见表5。

表5 料液比对肾茶滴丸提取工艺的影响

2.3.2 正交试验

称取适量肾茶药材于具塞锥形瓶中，按下表进行提取，提取两次，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪，按质量标准草案项下迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算迷迭香酸百分含量；同时取续滤液0.1mL于具塞试管，按质量标准草案项下熊果酸检测方法测定熊果酸含量，计算其中熊果酸百分含量；综合考虑，总含量/%=迷迭香酸百分含量+熊果酸百分含量，结果见表6。

表6 提取正交试验结果

表6(续)

对正交试验结果进行方差分析，结果如下：

表7 提取正交试验方差分析

从正交试验结果可以看出，3个因素对肾茶滴丸提取工艺的影响程度为：乙醇含量>提取时间>料液比，乙醇含量对正交试验结果的影响极显著，提取时间和料液比的影响不显著，并且影响程度相近。理论上最佳组合为A2B3C3，即理论最佳工艺条件为：乙醇浓度65%，料液比为1∶25，提取时间2h，但由于提取时间和料液比对总含量的影响并不显著，综合成本考虑最佳工艺条件定为：乙醇浓度65%，料液比为1∶15，提取时间2h。

2.4 肾茶提取工艺验证及提取次数的确定

2.4.1 提取工艺验证

称取适量肾茶药材于平底烧瓶中，按工艺条件乙醇浓度65%，料液比为1∶10，提取时间2h进行提取，90℃下提取150min，提取两次，过滤，合并两次滤液并定容，过0.45μm微孔滤膜，高效液相色谱仪设置进样量20μL，按质量标准草案项下熊果酸、迷迭香酸检测方法测定迷迭香酸含量，计算熊果酸、迷迭香酸含量；综合考虑，总含量/%=迷迭香酸含量+熊果酸含量，结果见表8。

表8 提取正交试验结果验证

验证试验结果可知，按最优工艺进行提取后，迷迭香酸含量平均值为0.3406%，熊果酸含量平均值为0.1697%，总含量0.5103%，均高于正交试验中其它各组数据，达到了优化的目的，该工艺稳定可行。

2.4.2 提取次数确定

称取适量肾茶药材于5个平底烧瓶中，按最优工艺A2B1C2进行提取，分别提取1次、2次，3次，4次，5次，收集提取液，过滤，量取体积，过0.45μm微孔滤膜，高效液相色谱仪设置进样量20μL，按内控质量标准草案项下迷迭香酸与熊果酸检测方法测定迷迭香酸与熊果酸含量，结果见表9。

表9 提取次数的确定

由结果可以看出，经过两次提取后，第2、3、4、5次提取液中迷迭香酸及熊果酸含量相近，因此确定肾茶滴丸提取次数为2次。

2.3 肾茶滴丸制备工艺

采用熔融法制备肾茶滴丸，使肾茶浸膏粉达到高度分散状态，提高肾茶滴丸中有效成分的溶出。聚乙二醇-4000和聚乙二醇-6000为水溶性载体材料，当与溶出介质接触时，药物随着水溶性载体的溶解而迅速溶出，能提高肾茶滴丸的溶解度和溶出速率。

2.3.1 肾茶滴丸制备工艺方案

以溶散时限、硬度、圆整度等为指标并综合考虑，首先对基质的选择、冷凝剂的选择、药物与基质配比的选择、助悬剂的选择、药液温度的选择、滴距的选择等进行单因素考察，在此基础上进行L9(34)正交试验，优选肾茶滴丸的最佳制备工艺，并对结果进行验证。其中：

(1)溶散时限：按照《中国药典》2015版第四部[3]通则0921项下崩解时限的方法进行，以溶散时限为指标，计分值见表10。

表10 滴丸溶散时限指标

(2) 硬度：记录从实验结果中随机抽取的5粒滴丸的硬度平均值，计分值见表11。

表11 滴丸硬度指标

(3) 圆整度记录从实验结果中随机抽取的5粒滴丸的圆整度平均值，计分值见表12。

表12 滴丸圆整度指标

综合考虑各因素，以总分为指标考察各因素对肾茶滴丸制备工艺的影响。

总分=溶散时限得分+硬度得分+滴丸圆整度得分。

2.4 滴丸制备工艺单因素实验

2.4.1 滴丸中基质的配比

采用PEG4000 和PEG6000采用不同比例进行溶散滴制试验，结果见表13。

表13 基质的配比滴丸制备工艺的影响

根据制剂中药物的性质，选择目前最为常用的水溶性基质聚乙二醇类(PEG4000和PEG6000)，PEG无毒无味，内聚力和分散力都有优势，是比较理想的滴丸基质，试验结果表明，PEG4000与PEG6000比例为7∶13时，肾茶浸膏粉能与基质较好的结合，制得滴丸硬度适中，圆整度较好，溶散时限短，故选择1∶4、7∶13、4∶1为正交试验基质比。

2.4.2 滴丸中冷凝剂的选择

根据《中国药典》对冷凝剂的要求，实验选择液体石蜡、二甲基硅油和大豆油三种溶剂作为冷凝剂。以滴丸的滴制情况，溶散时限、硬度及圆整度为考察指标，确定冷凝剂对滴丸制备工艺的影响，结果见表14。

表14 冷凝剂对滴丸制备工艺的影响

冷凝剂是制备滴丸的重要辅助剂，其密度和粘度直接影响药液的沉降速度和滴丸的圆整度。选择大豆油为冷凝剂时，滴丸沉降速度稍慢，下落后粘连，且滴丸呈扁圆形，圆整度较差；选择二甲基硅油为冷凝剂时，滴丸沉降速度稍慢，偶有粘连，可能是因为二甲基硅油表面张力小，与药液比重差大，黏滞大；选择液体石蜡为冷凝剂时，滴丸沉降速度适中，下落后不粘连，且滴丸圆整度好，硬度适中，溶散时限短，故选择液体石蜡为滴丸的冷凝剂。

2.4.3 滴丸中药物与基质配比的选择

考察药物与基质比例对滴丸制备工艺的影响，结果见表15。

药物浸膏粉(药物)与基质的比例值直接影响滴丸的质量，其比例一般情况下为1∶1～1∶10，但如果载药量过小，则不符合实际要求。结果表明，当药物含量为50%时，化料容易出渣，药液黏度大，不容易成形，滴制时容易堵滴头；因此选择20%、30%、40%作为正交试验的载药量。

表15 药物与基质的配比对滴丸制备工艺的影响

2.4.4 滴丸中助悬剂的选择

根据滴丸生产工艺要求，对助悬剂进行了考察，结果见表16。

表16 助悬剂对滴丸制备工艺的影响

从实验结果可以看出，硬脂酸和硬脂酸镁对滴丸硬度、圆整度鸿润溶散时限的影响较小。但对滴丸外观影响较大，除添加3%硬脂酸镁外，其余均可造成滴丸化料时出渣。故选择3%硬脂酸镁作为滴丸制剂所需助悬剂。

2.4.5 滴丸中药液温度的选择

药液温度考察结果见表17。

表17 药液温度对滴丸制备工艺的影响

药液温度低则粘滞度大，滴丸易拖尾，丸型差，滴制困难，滴制速度慢，丸重增加，丸重差异大；温度过高则药液变稀，容易出渣，滴制口滴出的药液呈线状，常拖尾呈哑铃状或串珠状而非滴丸，且温度太高可能对主药成分造成影响，故选择药液温度80℃、90℃、100℃为正交试验温度。

2.4.6 滴丸中滴距的选择

根据滴丸外形、规格的要求，在不同条件下对滴制情况进行了考察，其结果见表18。

滴制过程中，滴距过大，液滴会因重力作用被跌散而产生细粒，影响滴丸沉降速度，圆整度及丸重。同时，沉降速度增加，使得滴丸还未完全冷却成就已沉降到底，可能造成硬度不够及滴丸粘连现象。但滴距过小时，由于冷凝剂自身的表面张力作用，使得液滴漂浮在冷凝剂表面，不易沉降从而造成粘连。实验结果表明，当滴距为2 cm时，滴丸的成形性较好，综合评分较高。

表18 滴距对滴丸制备工艺的影响

2.5 滴丸制备工艺正交试验

2.5.1 制备工艺正交试验设计

通过单因素试验可知，基质配比、载药量、药液温度等因素对肾茶滴丸制备工艺影响较大，因此采用正交试验法对其进行优选，因素水平表见表19。

表19 滴丸制剂因素水平表

2.5.2 正交试验

取适量肾茶浸膏粉，按L9(34)正交表进行试验，并滴入液体石蜡中，测定滴丸溶散时限、硬度、圆整度，结果见表20。

表20 滴丸制剂正交试验结果

对正交试验结果进行方差分析，结果见表21。

表21 制剂方差分析表

由正交试验结果可知，影响滴丸成形的工艺的主要因素是药液温度，其次是基质(PEG4000：PEG6000)，影响最小的是药物载药量，载药量低药效减弱，但载药量过高化料时容易出现药渣聚集堵住滴头。方差分析结果表明，基质(PEG4000：PEG6000)及药液温度对滴丸滴制工艺有显著影响。综合考虑，最中确定滴丸最佳制备工艺为A2B2C3。即基质(PEG4000：PEG6000)为7∶13，载药量为30%，药液温度为100℃。但考虑到化料出渣以及有效物质热稳定性的问题，在条件允许的情况下，最终化料温度定为90℃。

2.5.3 滴丸制备工艺正交结果验证试验

验证滴丸制备工艺正交试验结果，结果见表22。

表22 正交试验结果验证

按照最佳制备工艺值制得的滴丸圆整度好，硬度高，丸重，溶散时限均符合要求。色泽均匀，成丸率在90%左右。结果表明，该工艺条件作为滴丸的最佳制备工艺，稳定可行。

3 讨论与展望

肾茶袋泡茶用的是温水浸泡，浸出物相比直接提取是相当少的，因此袋泡茶这一剂型大大限制了肾茶的药效。肾茶用稀醇提取可以充分获得其有效物质，既有极性大的物质又有极性小的物质，但梯度分析方法不能很好地同时检测迷迭香酸和熊果酸，因此可以对肾茶提取物和滴丸制剂中的标准物质进行同步检测的方法还有待研究，以期望能对肾茶提取物和肾茶滴丸制剂的质量进行更好的控制。

肾茶针对的疾病一般都是慢性病，而滴丸这种制剂生物利用度高、质量稳定还可以添加控释剂和缓释剂，能充分发挥肾茶的功效。由于滴丸相对于其他剂型比如片剂等载药量较低，因此剂量大的处方不适合制成滴丸制剂。目前大部分大生产用的滴丸机都是一体化的，简便易控，易操作，操作人员的培训效率高、成本低，对于药企来说滴丸这一剂型是必备的剂型。

影响中药滴丸制剂成型的因素非常多，内在因素就是中药提取物的物理性质，水提物比较容易成型，而醇提物由于有很多油性物质导致成型非常困难；外在因素有基质种类和配比、化料温度、滴距、丸重、冷却剂种类和冷却剂温度[4]。研究人员应根据实际情况选择合适的正交设计方法，确定最佳工艺，保证滴丸制剂安全、稳定、有效和可控。