硫喷妥钠对心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌Toll样受体4和核因子-κB表达的影响

潘文星 余云明 阳兴 周文 李洪军

心肌缺血-再灌注(ischemia reperfusion，I/R)损伤是指心肌在短暂缺血时呈现形态、功能及代谢障碍，而恢复血流灌注后出现的心肌细胞超微结构改变、心律失常、微血管内皮细胞损伤等一系列损伤加重的现象[1]。内皮细胞在维持血管正常功能中起关键作用，而I/R能够通过多种机制诱导血管内皮功能障碍，促进缺血性心脏病、急性心肌梗死等多种心血管疾病发展[2,3]。此外，有研究发现，心肌I/R损伤的发生常伴随着局部或全身的炎性反应，并且与Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)4、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)密切相关[4,5]。硫喷妥钠(Thiopental Sodium)是一种超短时作用的临床静脉麻醉药，具有作用快、呼吸道并发症少、诱导期短等特点[6]。本研究通过构建大鼠心肌I/R损伤模型，应用qRT-PCR、Western blot和ELISA法，观察了硫喷妥钠对I/R损伤模型大鼠心肌组织TLR4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)释放的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠20只，体重250～300 g，购自中国科学院上海实验动物中心[合格证号：SCXK(沪)：2016-0006]；Neoseptin 3购自杭州光远生物技术有限公司；一抗、HRP标记的二抗购自Abcam公司；TNF-αELISA试剂盒、IL-1β ELISA检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；TaKaRa反转录试剂盒、TaKaRa实时荧光定量试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol试剂、BCA试剂盒、PVDF膜、RIPA裂解液购自北京Solarbio公司；实时荧光定量引物由北京六合华大基因有限公司合成；RT-PCR仪、凝胶成像系统、购自美国Bio-Rad公司；微量核酸测定仪购自美国赛默飞世尔科技公司；生物技能实验系统购自成都泰盟有限公司；微型动物呼吸机购自上海奥尔科特生物公司。

1.2 I/R模型制备 大鼠适应性喂养2 d后禁食12 h，称重，按0.5 ml/100 g腹腔注射20%乌拉坦。待其呼吸平稳后，背位固定于手术台上。将电极插入大鼠四肢皮下，连接生物机能系统，描记标准肢体导联心电图，同时连接呼吸机，设定呼吸频率为60次/min，潮气量为1.5 ml/100 g。于心脏搏动最明显处，延肋骨走向剪开皮肤，暴露心脏。打开心包膜，在左冠状动脉前降支下穿一缝合线，打一松结，平衡10 min；松结内垫一充水0.5 ml的球囊，结扎造成心肌缺血，心电图ST段明显改变为结扎成功。30 min后排出球囊中的水，即刻实现血流再灌注，心电图ST段明显回落为血流再灌注成功，持续60 min，完成I/R动物模型。

1.3 实验分组 将20只健康SD大鼠随机分为4组，每组5只：假手术(sham)组、缺血+再灌注(I/R)组、缺血-再灌注+硫喷妥钠(I/R+T)组、缺血-再灌注+硫喷妥钠组+ TLR-4激活剂(I/R+T+Neoseptin 3)组。sham组：按100 μg/kg腹腔注射0.9%氯化钠溶液，左冠状动脉穿线但不结扎，观察90 min；I/R组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液，左冠状动脉前降支结扎缺血30 min，血流再灌注60 min；I/R+T组：按60 mg/kg腹腔注射1%硫喷妥钠注射液后30 min进行缺血-再灌注；I/R+T+Neoseptin 3组：按60 mg/kg腹腔注射1%硫喷妥钠和18.5 μmol/L Neoseptin 3 30 min后，进行缺血-再灌注。

1.4 qRT-PCR 取4组大鼠心肌组织适量，充分研磨，Trizol法提取总RNA，使用微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度。调整RNA样品浓度，使用TaKaRa反转录试剂盒和荧光定量试剂盒分别将RNA反转录为cDNA，并配制反应体系，以GAPDH为内参进行PCR扩增。实验结果采用2-ΔΔCt法进行分析，每个RNA样品重复3次。见表1。

表1 qRT-PCR引物及序列

1.5 Western blot 收集4组大鼠心肌组织剪碎，加入含蛋白酶抑制剂RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，4℃，12 000 g离心15 min取上清。BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品经SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Ⅰ抗4℃ 孵育过夜；TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的Ⅱ抗室温孵育2 h；TBST洗膜3次，ECL曝光显影，实验重复3次。

1.6 ELISA检测TNF-α和IL-1β水平 收集4组大鼠心肌组织剪碎，置于含蛋白酶抑制剂的预冷匀浆缓冲液中。匀浆后4℃、15 000 g离心10 min取上清，分别使用TNF-α ELISA检测试剂盒、IL-1β ELISA检测试剂盒检测大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β水平。

2 结果

2.1 I/R对大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB水平的影响 与sham组比较，I/R组大鼠心肌组织中TLR-4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表达均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

2.2 I/R对大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β释放的影响 经I/R处理的I/R组大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β水平显著高于sham组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 I/R对大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB水平的影响

图1 大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB蛋白电泳图

表3 I/R对大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β释放的影响

2.3 硫喷妥钠对I/R大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB表达的影响 I/R+T组大鼠心肌组织中TLR-4、NF-κB在mRNA和蛋白水平的表达显著低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表4。

图2 硫喷妥钠对I/R大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB蛋白水平的影响

2.4 硫喷妥钠对I/R大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β水平的影响 经硫喷妥钠麻醉后，I/R模型大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β水平显著低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表4 硫喷妥钠对I/R大鼠心肌组织TLR-4和NF-κB水平的影响

表5 硫喷妥钠对缺血-再灌注大鼠心肌组织TNF-α和IL-1β水平的影响

2.5 Neoseptin 3可逆转硫喷妥钠对I/R大鼠心肌损伤的抑制作用 I/R组的大鼠心肌组织TLR-4、NF-κB蛋白水平，TNF-α和IL-1β水平显著高于sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；而I/R+T组较I/R组大鼠心肌组织TLR-4、NF-κB表达水平显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-α和IL-1β水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+T+Neoseptin 3组大鼠心肌组织中TLR-4、NF-κB表达及TNF-α和IL-1β水平基本恢复至I/R组水平(P<0.05)。见图3，表6。

图3 TLR-4和NF-κB蛋白水平的表达

3 讨论

我国心血管疾病发病率和病死率呈上升趋势，其病死率在城乡居民总死亡原因中高居首位，造成了沉重的经济负担，其中急性心肌梗死患者的医疗费用占心血管疾病费用第1位[7]。急性心肌梗死是由血流供应急剧减少或持续性缺血导致的心肌坏死，同时引起心力衰竭、心律失常等并发症，严重威胁人体健康。据统计，2015年我国农村地区急性心肌梗死病死率为70.09/10万，城市地区为56.38/10万，糖尿病、高血压、年龄增长等是该病的危险因素[8,9]。经皮冠状动脉介入治疗、静脉溶栓治疗是急性心肌梗死临床治疗的主要措施，能够疏通患者阻塞的冠状动脉，恢复血流供应，保护心脏功能，而心肌I/R损伤是急性心肌梗死再灌注治疗中的一大障碍[10,11]。

表6 Neoseptin 3可逆转硫喷妥钠对I/R大鼠心肌损伤的抑制作用

目前普遍认为，心肌I/R损伤发生机制与自由基、白细胞激活、细胞内钙超载有关：自由基同时具有还原性和氧化性，当细胞内抗氧化物质不能有效清除自由基时，自由基的氧化作用引发脂质过氧化，从而破坏细胞膜结构与功能[12]；再灌注后，细胞中钙离子浓度增加，增强膜磷脂分解并降低ATP产生，引起细胞功能代谢障碍[13]；而白细胞在I/R前期黏附到内皮细胞，引起毛细血管壅塞，并生成活性氧等自由基，刺激细胞膜脂质过氧化，加重细胞、组织的损伤[14]。此外，有研究表明，Toll样受体(TLR)是机体免疫防御系统第一道防线的重要组成成分，能够识别病原，启动防御系统，同时能识别细胞损伤，诱导免疫应答调控损伤修复[15]。据报道，脂多糖能够促进TLR4活化，进而诱导NF-κB介导的炎性损伤[16]。NF-κB是细胞内重要的转录因子，与免疫应答、炎性反应等生物过程有关，能够刺激TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性细胞因子分泌，促进炎性反应[17]。多项研究表明，抑制TLR4表达和NF-κB活性，对缺血再灌注或慢性应激引起的心肌损伤具有保护作用[18,19]。本研究通过构建大鼠心肌I/R损伤模型并采用qRT-PCR、Western blot和ELISA法检测相关指标，发现I/R损伤模型大鼠心肌组织中TLR4和NF-κB在mRNA和蛋白水平的表达显著上调，TNF-α和IL-1β水平显著升高。

据报道，麻醉药具有心肌保护作用，能够通过调节一氧化氮合活性氧生成、维持细胞内钙平衡等改善I/R引起的心肌功能障碍[20]。Yan等[21]研究发现，乳化异氟醚可通过增强超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量发挥心肌保护作用；Steurer等[22]研究发现，经挥发性麻醉剂七氟醚预处理后，心肌组织中肌钙蛋白T、肌酸激酶显著降低；Galagudza等[23]研究发现，异氟醚、戊巴比妥、苯二氮卓类等药物均对I/R损伤的小鼠心肌具有保护作用。而硫喷妥钠在I/R引起的肾损伤中，能够抑制过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的降低，从而保护肾脏[24]；并对胎鼠脑缺血再灌注损伤发挥保护作用[25]；但硫喷妥钠在心肌I/R损伤中的作用暂无相关报道。本文通过使用硫喷妥钠预处理后建立大鼠心肌I/R损伤模型，发现大鼠心肌组织中TLR4和NF-κB表达及TNF-α和IL-1β水平显著下降；但使用TLR-4激活剂处理后，TLR4和NF-κB表达及TNF-α和IL-1β水平回升。

综上所述，硫喷妥钠能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低炎性细胞因子分泌，对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。提示，使用硫喷妥钠预处理后进行再灌注治疗可减轻心肌损伤，这一结果有望为克服心肌缺血再灌注损伤提供新靶点。