新型快速流行性感冒病毒抗原检测方法免疫荧光法在流行性感冒筛查中的应用价值研究

李晓光，陈静，王伟，李璐，林菲，贾莹，张碧莹，胥婕

本研究价值：

免疫荧光法是国内较新的流行性感冒（流感）检测方法，本研究将其与传统的快速流感病毒抗原检测方法免疫渗滤法和胶体金法对比，显示有一定优势。同时本研究细化年龄分层，发现随年龄增长，各检测方法的灵敏度有下降趋势，特别是当年龄＞60岁时，胶体金法检测甲型流感的灵敏度降低到65%，且3种方法对乙型流感的灵敏度仅为58%～67%。提示对于老年人，需要更加警惕快速流感病毒抗原检测结果的假阳性。

流行性感冒（流感）是常见的呼吸道传染病，据世界卫生组织（WHO）报道，季节性流感导致每年5%～10%的成年人、20%～30%的儿童发病，其中3 000 000～5 000 000例为重症患者，290 000～650 000例患者死亡［1］。流感疫情传播快、发展迅速，建立快速流感病毒抗原检测方法可为临床诊疗提供依据，避免抗生素滥用，促进抗病毒药物合理应用，也利于对疫情的监测及采取更有效的控制措施。

目前，传统快速流感病毒抗原检测方法，如胶体金法，与流感病毒核酸检测相比，灵敏度偏低，临床应用受到影响。免疫荧光法流感病毒抗原检测是一种新型快速流感病毒抗原检测方法，其基于免疫荧光法，配有自动化读取仪器，15 min出结果，是一种敏感而快速的流感诊断方法［2-3］，于2019年6月在中国上市。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测流感病毒核酸是常用的确诊流感病毒的方法之一。

本研究的目的是对季节性流感患者进行免疫荧光法检测，并与传统快速流感病毒抗原检测方法和RT-PCR方法进行比较，以探讨其在流感筛查、快速诊断中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 分别于2017年7—12月、2019年1—2月选取北京大学第三医院感染疾病科发热门诊收治的患者472例，其中男209例（44.3%），女263例（55.7%）；年龄16～86岁，平均年龄（37.3±17.5）岁。入选标准：具有发热（＞38 ℃）/咳嗽/咽痛症状之一，或者近14 d内与发热患者密切接触。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 采集患者鼻咽拭子，放入1 ml病毒保存液，4 ℃保存，2 h内检测。

1.2.2 检测方法 RT-PCR由分子生物实验室有试验资质的人员完成，其他试验属于床旁快速检测，由临床医生完成。各试验人员采用盲法分别进行试验。

1.2.2.1 免疫荧光法 采用购自Quidel Corporation的Sofia流感病毒抗原检测试剂盒，将260 μl鼻咽拭子样本加120 μl测试试剂混匀，滴入测试板，静置15 min，放入自动读取仪器（简称Sofia），读取结果。

1.2.2.2 免疫渗滤法 采用北京万泰生物药业股份有限公司生产的甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，利用免疫渗滤技术结合双抗体夹心法检测甲型/乙型流感病毒抗原：将200 μl样品加入400 μl裂解液后混匀，加入加样孔，静置10 min，加入酶标试剂，静置2～3 min，洗涤2次，加入显色剂，静置2 min，加入终止液，静置3 min，观察结果。

1.2.2.3 胶体金法 采用广州万孚生物技术有限公司生产的甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，利用免疫层析技术结合双抗体夹心法检测甲型/乙型流感病毒抗原：向测试卡的加样孔中滴加80 μl溶解有待测样本的转运保存液，15～20 min观察结果。

免疫荧光法、免疫渗滤法与胶体金法的工作原理、操作方法差异详见表1。

1.2.2.4 RT-PCR方法 采用中国南京硕世生物科技有限公司生产的流感病毒核酸检测试剂盒，以甲型流感M蛋白基因和乙型流感N蛋白基因编码区的保守区为靶区域，使用试剂盒自带的引物和探针在同一反应体系中同时检测甲型和乙型流感病毒。检测时加入140 μl鼻咽拭子样本，进行核酸提取、PCR扩增。以RT-PCR方法为金标准。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以（x ±s）表示，计数资料采用相对数表示。制作诊断性试验四格表，进行诊断效能分析。

2 结果

2.1 流感病毒阳性检出率

2.1.1 免疫荧光法 472例患者中，共检出甲型/乙型流感262例，总阳性检出率为55.5%，其中甲型流感169例，阳性检出率为35.8%；乙型流感93例，阳性检出率为19.7%。

表1 免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法检测方法学比较Table 1 Methodological comparison of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique

2.1.2 免疫渗滤法 472例患者中，共检出甲型/乙型流感247例，总阳性检出率为52.3%，其中甲型流感159例，阳性检出率为33.7%；乙型流感88例，阳性检出率为18.6%。

2.1.3 胶体金法 472例患者中，共检出甲型/乙型流感259例，总阳性检出率为54.9%，其中甲型流感162例，阳性检出率为34.3%；乙型流感94例，阳性检出率为19.9%。另有3例同时检出甲型流感和乙型流感。

2.1.4 RT-PCR 472例患者中，共检出甲型/乙型流感292例，总阳性检出率为61.9%，其中甲型流感195例，阳性检出率为41.3%；乙型流感94例，阳性检出率为19.9%。另有3例同时检出甲型流感和乙型流感。

2.2 免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法与RT-PCR方法的检测结果比较

2.2.1 免疫荧光法与RT-PCR方法的检测结果比较 对于甲型/乙型流感联合检测，免疫荧光法灵敏度为89.0%（260/292），特异度为98.9%（178/180），阳性预测值为99.2%，阴性预测值为84.8%，阳性似然比为80.1，阴性似然比为0.124，准确度为92.7%（438/472）。

对于甲型流感单独检测，免疫荧光法灵敏度为85.4%（169/198），特异度为100.0%（274/274），阳性预测值为100.0%，阴性预测值为90.4%，阴性似然比为0.146，准确度为93.9%（443/472）。

对于乙型流感单独检测，免疫荧光法灵敏度为93.8%（91/97），特异度为99.5%（373/375），阳性预测值为97.8%，阴性预测值为98.4%，阳性似然比为175.9，阴性似然比为0.062，准确度为98.3%（464/472）。

2.2.2 免疫渗滤法与RT-PCR方法的检测结果比较 对于甲型/乙型流感联合检测，免疫渗滤法灵敏度为82.9%（242/292），特异度为97.2%（175/180），阳性预测值为98.0%，阴性预测值为77.8%，阳性似然比为29.8，阴性似然比为0.176，准确度为88.3%（417/472）。

对于甲型流感单独检测，免疫渗滤法灵敏度为79.3%（157/198），特异度为99.3%（272/274），阳性预测值为98.7%，阴性预测值为96.9%，阳性似然比为108.6，阴性似然比为0.209，准确度为90.9%（429/472）。

对于乙型流感单独检测，免疫渗滤法灵敏度为87.6%（85/97），特异度为99.2%（372/375），阳性预测值为96.6%，阴性预测值为96.9%，阳性似然比为109.5，阴性似然比为0.125，准确度为96.8%（457/472）。

2.2.3 胶体金法与RT-PCR方法的检测结果比较 对于甲型/乙型流感联合检测，胶体金法灵敏度为84.6%（247/292），特异度为93.3%（168/180），阳性预测值为95.4%，阴性预测值为78.9%，阳性似然比为12.7，阴性似然比为0.165，准确度为87.9%（415/472）。

对于甲型流感单独检测，胶体金法灵敏度为79.3%（157/198），特异度为97.1%（266/274），阳性预测值为95.2%，阴性预测值为86.6%，阳性似然比为27.2，阴性似然比为0.213，准确度为89.6%（423/472）。

对于乙型流感单独检测，胶体金法灵敏度为89.7%（87/97），特异度为97.3%（365/375），阳性预测值为89.7%，阴性预测值为97.3%，阳性似然比为33.6，阴性似然比为0.106，准确度为95.8%（452/472）。

以RT-PCR方法为金标准，免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法对流感检测结果的四格表见表2。

2.3 免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法对流感分型检测结果 根据RT-PCR方法检测结果对195例甲型流感进一步进行H1和H3分型，检测出H1型60例，H3型131例，4例未检测出分型。对3例同时检测出甲型流感和乙型流感者再进行甲型流感分型检测，结果1例为H1型，2例仅测出乙型流感，未测出甲型流感分型。综上，共检测出甲型H1型流感61例，甲型H3型流感131例，乙型流感96例。

免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法对不同流感分型检测结果见表3。

2.4 不同年龄分层免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法检测流感的灵敏度、特异度比较 按照年龄分层，16～20岁57例（12.1%）、21～40岁277例（58.7%）、41～60岁69例（14.6%）、＞60岁69例（14.6%）。免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法检测流感的灵敏度、特异度见表4。

3 讨论

流感病毒核酸检测是目前确诊流感最重要的手段之一，但其费用较高，耗时长，很多医疗机构和流感监测点尚不具备相应的人员和设备。快速流感病毒抗原检测方法简单、快捷，只需在床旁操作，一般医务人员可以学习掌握，近年来在流感筛查中得到了广泛应用。然而，传统的快速流感病毒抗原检测方法灵敏度差异很大［4-5］，临床上需要探索灵敏度更高的流感快速筛查方法。

表2 以RT-PCR方法为金标准，免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法对流感检测结果（n=472，例）Table 2 Results of influenza virus antigen detection by immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique，with RTPCR as the gold standard

表3 免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法对流感分型符合率〔n（%）〕Table 3 Diagnostic accuracy of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique for different influenza virus subtypes with RT-PCR as the gold standard

表4 不同年龄分层免疫荧光法、免疫渗滤法、胶体金法检测流感的灵敏度、特异度（%）Table 4 Detection sensitivity and specificity of immunofluorescence assay，immunofiltration assay，and colloidal gold technique for influenza in four age groups

本研究472例患者均采用3种方法检测，结果显示免疫荧光法无论是对甲型/乙型流感联合检测，还是甲型流感、乙型流感单独检测，灵敏度、特异度均最高，其中灵敏度分别为89.0%、85.4%、93.8%，特异度分别为98.9%、100.0%、99.5%。

免疫荧光法流感病毒检测系统可以连接VIRENA远程数据管理系统，并且将检测结果通过网络上传至被授权的公共卫生管理机构，以达到对流感疫情的实时监控［6］。TEMTE等［7］在美国威斯康星州19个初级医疗机构通过免疫荧光法对流感疫情进行近乎于实时的监测，并向公共卫生机构无线传输，每周统计流感检测阳性数据，通过与RT-PCR方法检测流感阳性的独立的监测系统进行比较，结果证实免疫荧光法能够早期监测到流感疫情的暴发，与RT-PCR网络实验室的数据相匹配。

免疫荧光法与其他快速流感病毒抗原检测方法对比，诊断准确性具有一定优势。本研究与其他研究结果相似，但本研究的样本量更大，且覆盖2个流感季节。RYU等［8］的研究纳入218例患者并比较3种数字快速流感病毒抗原检测方法和1种传统床旁快速流感病毒抗原检测方法对于甲型流感的检测效能，结果仪器BUDDI、Sofia、Veritor和胶体金便携检测试剂盒Bioline的灵敏度分别是87.7%、94.5%、87.7%和72.6%，特异度分别是100.0%、97.7%、96.5%和100.0%。YANG等［9］的研究纳入109例患者，结果显示Sofia免疫荧光法检测甲型流感的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为82%、89%、77%和89%。孔凡明［10］的研究纳入100例流感患者，结果显示Sofia免疫荧光法阳性检出率为95%，而胶体金法（用GICA检测试剂）阳性检出率仅为62%。杨静红等［11］的研究纳入168例流感样患者，结果显示Sofia免疫荧光法阳性检出率为17.86%，高于胶体金法（用GICA检测试剂）的8.93%，若以RT-PCR为金标准，则Sofia免疫荧光法对甲型流感和乙型流感的灵敏度分别为83.3%和71.4%，特异度为100.0%。

免疫荧光法对流感患者明确诊断，指导诊疗，改善预后均有一定意义。DIALLO等［12］应用Sofia免疫荧光法对238例儿科急诊患儿进行检测，结果阳性组因为得到诊断较明确，后续生化检查（20%与56%，P＜10-7）和影像学检查（23%与52%，P＜10-5）的比例明显减少，住院率降低（0.8%与9.1%，P=0.009）。

本研究的研究对象可能存在采样时间偏倚和年龄偏倚。本研究中病原体的阳性检出率高，免疫荧光法、RT-PCR方法分别为53.1%和59.4%。分析原因：研究对象主要是流感样病例患者和密切接触者，采样时间主要集中在2017年底和2019年初的两个流感流行季节，这符合临床需求，但可能存在时间偏倚。本研究中研究对象年龄介于16～86岁，范围广，但仍以青年为主，40岁以下者占70.8%。今后应扩大研究对象纳入范围，以增加老年人、儿童比例。另外本研究中不同年龄组的流感检测灵敏度随年龄增长而降低，但特异度没有明显降低。今后可改进仪器，通过调整荧光读取范围，适当降低特异度而增加对高龄患者流感检测的灵敏度。

本研究的另一个局限性是金标准的选择。既往研究常选流感病毒分离、细胞培养作为金标准，但是这些方法阳性检出率低，现已逐步被快速准确的核酸检测方法取代。核酸检测方法过于敏感，本身有假阳性风险，当病毒载量很低时，即使检出阳性，对临床的指导意义也需要评估。本研究发现免疫荧光法对甲型流感H1亚型和H3亚型分型符合率存在差异（91.8%与84.7%）。此前BAAS等［13］研究显示，免疫荧光法无法检测出多数H7N9亚型流感，需要在未来的研究中对免疫荧光法检测流感亚型的效能进行评估。

目前还有许多关于流感快速检测方法的新探索，如GARDINER等［14］采用二步法进行呼吸道病毒感染诊断方法的研究，即首先采用免疫荧光法进行筛查，对阴性者，再用一种快速核酸检测仪器BiofireFilmarray进行检测，经过测算，可以更精确、快速、节约成本；刘冬兰等［15］采用流式细胞仪及直接荧光素标记抗体以检测鼻咽拭子上皮细胞的流感病毒抗原。

总之，与传统快速流感抗原检测方法比较，免疫荧光法在甲型/乙型流感的检测中表现出更高的灵敏度，在流感筛查中有一定应用前景。建议今后流感样患者诊治过程中先进行免疫荧光法快速筛查，必要时再考虑用快速核酸检测方法对结果进行验证，但免疫荧光法尚不能作为治疗或其他管理决策的唯一依据。

作者贡献：李晓光进行文章的构思与设计，结果的分析与解释，撰写论文；李晓光、陈静进行研究的实施与可行性分析，统计学处理，论文的修订；陈静、王伟、李璐、林菲、贾莹、张碧莹进行数据收集；李晓光、陈静、王伟、李璐、林菲进行数据整理；胥婕负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。