氧化苦参碱对病毒性心肌炎小鼠心肌中Bcl-2及Bax表达的影响及意义

田琳 何春枝 陈咏丽 董善武

(武汉市第四医院 华中科技大学同济医学院附属普爱医院儿科，湖北 武汉 430000)

临床医学将由病毒感染导致的心肌组织炎症病变称为病毒性心肌炎，是一种临床较为常见的感染性心肌疾病〔1，2〕。病毒性心肌炎主要临床表现为发热、倦怠、恶心呕吐等，随着病情的发展会出现胸痛、心悸、呼吸困难等症状〔3〕。目前临床较为常用的治疗病毒性心肌炎的手段为使用抗病毒药物进行治疗，但治疗效果并不十分理想，因此许多专家学者致力于使用中药治疗病毒性心肌炎的研究。氧化苦参碱是一种广谱的生物碱，主要提取自苦参、广豆根，具有抗炎、抑瘤、利尿、调节免疫等诸多药理作用，临床用途较广泛，氧化苦参碱具有神经保护及心肌细胞保护作用，但是关于氧化苦参碱治疗病毒性心肌炎的研究还较少〔4，5〕。本研究建立病毒性心肌炎小鼠模型，使用氧化苦参碱干预，观察效果。

1 材料与方法

1.1材料 选取25只SD雄性小鼠〔湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002，实验单位使用许可证号：SYXK(湘)2015-0017〕，3～6月龄，平均(4.5±1.3)月龄，体重212～247 g，平均体重(228.9±12.5)g。小鼠均于干净笼子内喂养，喂养环境设定为室温(22.5±2.6)℃，相对湿度35%～40%，光照12 h/d，喂养7 d。本研究获医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1建模及分组 随机选取5只小鼠为正常组，不做处理，其余20只小鼠建立病毒性心肌炎模型：使用0.2 ml CVB3病毒稀释液对小鼠进行腹腔注射接种，共接种4次，每两次之间间隔5 d，第4次接种1 d之后开始用药干预。正常组与模型组小鼠均使用生理盐水进行干预；药物对照组小鼠使用100 mg/kg利巴韦林溶液进行干预，1次/d；低剂量组小鼠使用6.25 mg/kg氧化苦参碱溶液进行干预，1次/d；高剂量组小鼠使用25 mg/kg氧化苦参碱溶液进行干预，1次/d。各组小鼠均干预14 d。

1.2.2心功能指标检测 对所有大鼠进行麻醉处理，使小鼠保持仰卧位并进行固定、剃毛。将小鼠的躯体向左倾斜30°左右，并将多普勒超声检测仪探头置于小鼠胸骨的左侧，使探头与小鼠胸骨中线部位保持10～30°夹角，对心功能指标进行检测。

1.2.3苏木素-伊红(HE)染色 对各组小鼠进行全麻处理，采用断头法处死，取心尖部心肌组织，液氮冷冻后常规脱水、透明、石蜡包埋，间距5 mm做连续切片。将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入不同浓度的酒精中各复水3 min。使用苏木素染色15 min后清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用酒精进行脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察。

1.2.4指标检测 使用酶法速率法检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平；酶联免疫吸附试验法检测白细胞介素(IL)-8、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平；使用免疫透射比浊法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平；使用Western印迹法检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)相对表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行F值检验、单因素分析。

2 结 果

2.1心肌组织病理学观察 正常组心肌纤维排列整齐且胞质丰富均匀，细胞间隙正常，无病理变化；模型组可见多数炎性细胞浸润，且伴有心肌细胞坏死情况，高剂量组炎性细胞浸润及心肌细胞坏死情况明显缓解，心肌纤维数量增多，心肌损伤获得改善。见图1。

图1 各组心肌组织病理组织学观察(HE，×200)

2.2各组心功能指标水平比较 模型组左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)水平高于正常组，左室射血分数(LVEF)水平低于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；药物对照组、低、高剂量组LVEDd、LVESd水平均低于模型组，LVEF水平高于模型组，且高剂量组LVEDd、LVESd水平均低于药物对照组、低剂量组，LVEF水平高于药物对照组、低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组LDH、CK-MB、CK水平比较 模型组LDH、CK-MB、CK水平均高于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；药物对照组、低、高剂量组LDH、CK-MB、CK水平均低于模型组，且高剂量组LDH、CK-MB、CK水平均低于其他两组，具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标水平及LDH、CK-MB、CK水平比较

2.4各组IL-8、CRP、TNF-α水平比较 模型组IL-8、CRP、TNF-α水平均高于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；药物对照组、低、高剂量组IL-8、CRP、TNF-α水平均低于模型组，且高剂量组IL-8、CRP、TNF-α水平均低于其他两组，具有统计学差异(P<0.05)。见表2。

2.5各组MDA、SOD、GSH-Px水平比较 模型组MDA水平高于正常组，SOD、GSH-Px水平低于正常组，具有统计学差异(P<0.05)；药物对照组、低、高剂量组MDA水平低于模型组，SOD、GSH-Px水平高于模型组，且高剂量组MDA水平低于药物对照组、低剂量组，SOD、GSH-Px水平高于药物对照组、低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组IL-8、CRP、TNF-α、MDA、SOD、GSH-Px水平比较

2.6各组Bcl-2、Bax相对表达量对比 模型组Bcl-2表达低于正常组，Bax表达高于正常组；药物对照组、低、高剂量组Bcl-2表达高于模型组，Bax表达低于模型组，且高剂量组Bcl-2表达高于药物对照组、低剂量组，Bax表达低于药物对照组、低剂量组，具有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 各组Bcl-2、Bax相对表达量对比

3 讨 论

临床研究表明，病毒性心肌炎症状的发生发展会对患者心功能造成严重的影响，LVEDd、LVESd、LVEF是临床较为常用的评价机体心功能的指标〔6,7〕。本研究结果说明使用氧化苦参碱干预能够明显改善病毒性心肌炎小鼠心功能。

CK、CK-MB、LDH能够较为直观、准确地反映出机体心肌损伤的程度，其表达水平的变化与病毒性心肌炎的发生发展密切相关。CK在机体心肌及骨骼肌中大量表达，是较为常用的心血管疾病的诊断指标〔8〕；CK-MB作为CK的特异性同工酶，在机体心肌细胞中大量表达〔9〕；LDH作为一种非特异性心肌酶，在心肌组织中大量表达〔10〕。本研究结果显示，病毒性心肌炎小鼠CK、CK-MB、LDH水平呈现异常高表达，使用高剂量氧化苦参碱进行干预后，CK、CK-MB、LDH水平明显下降，出现这一研究结果的原因可能是使用高剂量氧化苦参碱进行干预，能够减轻病毒性心肌炎小鼠心肌组织损伤严重程度，调控CK、CK-MB、LDH水平。

病毒性心肌炎症状的发生发展通常会伴随机体炎症反应〔11〕。IL-8水平与炎症反应密切相关〔12〕。CRP主要由肝脏合成的糖蛋白，在人机体出现炎性反应、肿瘤及组织损伤时，其会呈现出高表达的状态，属于一种急性期反应物，在临床上常被用作检测炎性反应及免疫防御功能的标志物〔13〕。TNF-α一种多功能炎症细胞因子，能够介导嗜酸性粒细胞、淋巴细胞在炎症部位聚集，刺激这些细胞产生IL-6、IL-8等因子，从而使机体产生持续存在的炎症反应〔14〕。本研究结果说明病毒性心肌炎的发生发展伴随着机体心肌组织炎症反应。使用高剂量氧化苦参碱进行干预后，IL-8、CRP、TNF-α水平明显下降，说明使用氧化苦参碱进行干预，能够调控IL-8、CRP、TNF-α水平，减轻病毒性心肌炎小鼠心肌组织炎症反应，从而起到心肌保护作用。

MDA是一种脂质过氧化的重要产物，MDA的异常表达会加剧细胞膜的受损伤程度，还可以影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性〔15〕。SOD是一种可以对超氧阴离子的自由基进行清除的一种抗氧化酶，在机体中广泛存在，是细胞膜系统结构和功能完整性的保护性酶〔16〕。GSH-Px作为一种重要的过氧化物酶，能够将机体内的过氧化氢及对机体有害的过氧化代谢产物清除，从而保护机体细胞结构及功能的完整性〔17〕。本研究结果说明氧化苦参碱能够调控MDA、SOD、GSH-Px水平，从而起到改善病毒性心肌炎小鼠抗氧化能力、减轻心肌细胞氧化损伤严重程度的作用。

病毒性心肌炎症状的发生发展诱发机体心肌细胞凋亡〔18〕。Bcl-2、Bax是线粒体细胞凋亡通路中的重要基因，二者表达水平的变化与细胞凋亡密切相关〔19,20〕。本研究结果说明氧化苦参碱能够对Bcl-2、Bax的表达进行调控，从而起到抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡、减轻心肌受损严重程度的作用。

综上所述，使用高剂量氧化苦参碱对病毒性心肌炎小鼠进行干预，能够改善小鼠心功能及心肌酶水平，抑制炎症反应，提升抗氧化能力，调控Bcl-2、Bax的表达，减轻小鼠心肌受损严重程度。