长春西汀对慢性脑缺血大鼠神经功能保护机制的研究

王 刚，仲婷婷，蒋 毅，陈玺龙，王小琴，王慧云

慢性脑缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是指由各种病因诱发的脑血流长期灌注不足，在多种神经系统疾病病程中起关键作用[1]。慢性脑缺血的早期临床表现主要为记忆下降及逐渐进展的认知和运动障碍，病理损伤机制及神经保护机制复杂，目前尚未完全明确，严重影响病人及家属的日常工作及生活[2]。据统计，慢性脑缺血发病率在我国呈现逐年增高趋势，其原因与现代人群饮食方式改变及老龄化进程加剧有关[3]。因此，对慢性脑缺血发病机制及治疗方案的研究，已成为临床亟待解决的问题。临床对慢性脑缺血发病机制的研究主要集中在神经递质功能紊乱、氧化应激、细胞凋亡、突触异常、炎症损伤、能量代谢障碍等方面[4]；对其神经功能保护方面，研究主要集中在是神经再生、神经再生障碍、神经营养因子和抑制性因子等方面，虽已取得了可喜的成果，但仍存在部分不足[4]。有研究表明，长春西汀有明显的“益智作用”，并对脑缺血后神经功能具有一定的保护作用[5]。本研究观察长春西汀对慢性脑缺血大鼠的神经保护机制，为临床治疗慢性脑缺血提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康成年Wistar 大鼠30只，雄性，鼠龄 3～4 个月，体重(270±30)g，动物领取后置于洁净饲养笼中饲养1周开始进行实验，饲养湿度 70%，温度(22±3) ℃，自由饮水，昼夜正常交替。

1.2 试剂与仪器 长春西汀注射液[商品名：润坦，河南润弘制药股份有限公司生产，国药准字H20041792，规格：每支2 mL(20 mg)]；Nogo-A一抗、OMgp一抗及MAG一抗均购自北京博奥森生物工程有限公司；兔抗大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)抗体、兔抗大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 抗体、兔抗小鼠白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)抗体均购自美国Abcam 公司；LEICA ASP200S自动脱水机(德国)；LEICA EG1150H 组织包埋机(德国)；LEICA图像采集分析系统(德国)。

1.3 分组及造模 30只Wistar 大鼠依据随机数字表法分为假手术组、模型组及长春西汀组，每组10只，模型组及长春西汀组使用双侧颈总动脉永久性阻断法(bilateral common carotid artery permanent occlusion，2VO)[6]制作大鼠慢性脑缺血模型。方法：大鼠术前12 h禁食、禁水，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，颈正中切开后，钝性分离游离双侧颈总动脉，分别结扎其远心端、近心端，从中间剪断，以确保颈总动脉无血流通过，缝合切口，术后各组大鼠均在常规条件下饲养。假手术组以相同方法行颈前皮肤切开，分离、暴露但不结扎双侧颈总动脉，逐层缝合切口。长春西汀组于2VO术后 24 h内给予长春西汀10 mg/kg腹腔内注射，假手术组、模型组给予等量生理盐水注射，共注射21 d。

1.4 观察指标 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组大鼠脑组织匀浆中IL-1β、IL-10、TNF-α含量；使用免疫组化法检测大鼠海马区组织中勿动蛋白 (Nogo-A)、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)表达情况；采用免疫组化法结合图像分析，检测各组大鼠海马CA1区脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达。

2 结 果

2.1 3组大鼠脑组织匀浆中 IL-1β、IL-10、TNF-α含量比较 模型组及长春西汀组脑组织匀浆中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手术组(P<0.05)，IL-10含量则均低于假手术组(P<0.05)；长春西汀组大鼠脑组织匀浆中 IL-1β、TNF-α含量低于模型组(P<0.05)，IL-10含量则高于模型组(P<0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠脑组织中IL-1β、IL-10、TNF-α含量比较(±s) 单位：ng/mL

2.2 各组大鼠海马组织中 Nogo-A、OMgp、MAG表达比较 假手术组及长春西汀组大鼠海马组织中 Nogo-A、OMgp、MAG表达均低于模型组(P<0.05)；长春西汀组大鼠海马组织中 Nogo-A、OMgp、MAG表达高于假手术组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠海马组织中 Nogo-A、OMgp、MAG表达比较(±s)

2.3 各组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达比较 假手术组及长春西汀组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达均高于模型组(P<0.05)；长春西汀组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达低于假手术组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达比较(±s)

3讨 论

慢性脑缺血是临床常见病，多发于中老年人群，主要临床症状可表现为头晕、视物不清、头重等，严重时可造成病人神经功能损伤，对病人正常工作及身心健康影响极大[7]。慢性脑缺血病理过程复杂，是因慢性脑灌注下降导致脑功能障碍的临床综合征，相对于急性或亚急性脑缺血，其具有可干预时间窗较长的特点，如能早期诊断并积极治疗，可有效阻断疾病进展，降低脑血管相关事件发生的风险[8-9]。有研究表明，在脑灌流不足所诱发的系列级联反应过程中，免疫炎症反应可贯穿脑损伤的全过程[10-11]。而在多梗死灶型血管性痴呆及阿尔茨海默病病人外周血中，炎性因子含量均异常，表明炎性因子参与脑灌注不足所诱发的系列级联反应过程[12]。另有实验证实，脑缺血时内皮细胞炎症反应使被激活的巨噬细胞、少突胶质细胞等释放大量的IL-1β、TNF-α，从而激活促炎反应[10，13]。IL-1β、TNF-α在脑缺血损伤中的作用已有很多相关报道，而IL-10在脑缺血损伤中的作用报道相对较少。本研究对大鼠脑组织匀浆中IL-1β、IL-10、TNF-α含量进行检测后发现，模型组及长春西汀组脑组织匀浆中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手术组(P<0.05)，IL-10含量则均低于假手术组(P<0.05)；长春西汀组大鼠脑组织匀浆中 IL-1β、TNF-α 含量低于模型组(P<0.05)，IL-10含量则高于模型组(P<0.05)。表明长春西汀可抑制慢性脑缺血大鼠炎症反应，有利于减轻缺血、缺氧对神经元的损害。中枢神经系统具有一定的再生能力，但轴突再生抑制因子可阻碍神经系统损伤后的神经功能恢复，而Nogo-A、OMgp及MAG 是机体主要的神经生长抑制因子，在慢性脑缺血时Nogo-A、OMgp及MAG表达明显增强[14-15]。大脑海马区CA1区神经保护因子对脑区神经元缺血损伤较为敏感，而BDNF通过与其受体TrkB的结合，启动细胞内信号转导途径，发挥神经保护作用[16-17]。VEGF则通过与其受体 VEGFR2结合，发挥促进微血管生成及血管内皮细胞增殖作用，使受损病变区域血供恢复，进而修复受损神经元[18-19]。本研究结果显示，模型组大鼠海马组织中 Nogo-A、OMgp、MAG阳性表达最高，长春西汀组次之，假手术组则最低；假手术组及长春西汀组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达均高于模型组(P<0.05)；长春西汀组大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达低于假手术组(P<0.05)。证实长春西汀对慢性脑缺血大鼠神经保护作用机制可能是通过抑制Nogo-A、OMgp及MAG过度表达，促进大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达来实现的。

综上所述，长春西汀通过抑制慢性脑缺血大鼠炎性反应及大脑海马区 Nogo-A、OMgp 、MAG 的表达，促进大鼠海马CA1区BDNF及VEGF表达，从而发挥神经保护作用。