microRNA-497在麝香保心丸调控急性心肌梗死心室重构中作用机制的实验研究

黎镇赐，吕 婧，刘 震，黄建楷，潘艺朝，吴 琪，李 解

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠状动脉急性缺血缺氧引起的心肌坏死。临床表现为剧烈而持久的胸骨后疼痛、血清肌钙蛋白I(troponin I，TnI)、肌红蛋白(myoglobin，MB)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)等心肌酶活性增高，以及心电图进行性改变，可累及消化、呼吸、心血管系统，并发心律失常、心脏破裂、心力衰竭、血管栓塞、心源性休克等，危及病人生命[1]。目前，AMI是欧美国家最常见心血管疾病，美国每年有将近150万人发生心肌梗死。而我国近年来AMI的发病率亦呈明显上升趋势，每年新发至少50万人[1-2]。可见，AMI是我国重要的公共卫生问题，也是临床急需解决的重要疾病。AMI后心室重构是引起心力衰竭的主要原因。在此过程中，心室的大小、结构以及心脏功能发生变化，主要包括：心肌梗死区膨出，非梗死区心肌肥大、室壁增厚、心肌间质纤维化等表现。目前临床尚无治愈心力衰竭的方法，因此，探索AMI后心室重构的治疗方法成为当务之急[2]。

麝香保心丸具有改善血流动力学、缓解心绞痛、改善心肌缺血等作用，已成功应用于冠心病和AMI等多种心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的治疗[3]。microRNA-497(miRNA-497)是一种单链非编码小RNA分子，可参与转录后基因表达调控[4]。有研究显示miRNA-497可能在AMI后心室重构中扮演重要角色[5]。麝香保心丸对AMI后心室重构具有改善作用[6]，但麝香保心丸改善AMI后心室重构的分子学基础是否为miRNA-497尚不清楚。因此，本研究探讨miRNA-497在麝香保心丸改善AMI后心室重构中的作用，以期明确miRNA-497与麝香保心丸改善AMI后心室重构的关系，为AMI后心室重构的治疗提供新的选择，也为后续的药物开发及新治疗方案制定提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠75只(SPF级，雄性，体质量300～340 g)，购于上海抗体药物国家工程研究中心有限公司[生产许可：SYXK(沪)2018-0041]。75只SD大鼠随机分为A组、B组、C组、D组、E组，每组15只。

1.2 造模及干预方法 AMI大鼠模型采用结扎左冠状动脉前降支的方法。实验操作：腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠溶液(天津兰洪新能源科技有限公司)麻醉大鼠，剪去胸部被毛并消毒，于胸骨左缘第2肋～第4肋开胸，结扎冠状动脉左前降支。造模成功的判断标准：结扎区域变白，且心电图显示ST段弓背上抬。A组为空白对照组，仅分离前室间支，不结扎。B组、C组、D组、E组均为造模组。C组尾静脉注射miRNA-497激动剂(广州锐博生物有限公司)15 mg/kg，每日1次，连续3 d，灌胃麝香保心丸(上海和黄药业有限公司)15 mg/kg，每日1次，连续6周；D组尾静脉注射miRNA-497抑制剂(广州锐博生物有限公司)15 mg/kg，每日1次，连续3 d，灌胃麝香保心丸(上海和黄药业有限公司)15 mg/kg，每日1次，连续6周；E组灌胃麝香保心丸(上海和黄药业有限公司)15 mg/kg，每日1次，连续6周；B组给予等量生理盐水(上海艾研生物科技有限公司)。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况 6周后，观察大鼠精神状态、活动频度、呼吸频率、捕捉抵抗、毛发状态、进食量以及是否存活。

1.3.2 心功能指标 麻醉各组大鼠，行右侧颈总动脉插管(将连接压力换能器的插管经右侧颈总动脉逆行插入左心室)，通过PowerLab生物信号采集与分析系统(中国香港友诚生物科技有限公司)，测定并记录左室收缩末压(left ventricular end systolic pressure，LVESP)、左室内压最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室内压最大下降速率(LV-dp/dtmax)。

1.3.3 AMI面积 将各组大鼠处死，摘取心脏，左心室部分称重后切成1～1.5 mm心肌薄片，将心肌薄片置于1% 2，3，5氯化三苯基四氮唑溶液(北京索莱宝科技有限公司)中，37 ℃避光孵育10 min，用滤纸吸干，称重，梗死区域呈白色，非梗死区域呈红色，切下梗死区称重，AMI面积=(AMI重量/左心室重量)×100%。

1.3.4 大鼠心肌组织形态学变化 取各组大鼠心肌组织，固定，脱水，透明，包埋，切片，脱蜡，脱水，伊红-苏木素(eosin-hematoxylin，HE)染色试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)染色，脱水，透明，封片，光学显微镜(重庆奥特光学显微镜有限公司，型号：MDS400)下观察心肌组织形态学变化。

1.3.5 心肌细胞凋亡率 取各组大鼠心肌组织，进行原代细胞培养。取第3代心肌细胞，细胞悬液的细胞计数为1×106个，取1支洁净流式管，依次加入100 μL细胞悬液、5 μL异硫氰酸荧光素(天津希恩思生化科技有限公司)、5 μL碘化丙啶(武汉艾美捷科技有限公司)，充分混匀，25 ℃避光反应15 min，采用流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：FACSCalibur)检测心肌细胞凋亡率。

1.3.6 大鼠心肌组织中miRNA-497表达量 提取大鼠心肌组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA(Takara公司提供的逆转录试剂盒)，本实验采用ABI 7300 Real-time PCR系统对miR-497基因的表达水平进行相对定量分析。使用的Real-time PCR的上游引物/下游引物均由上海英骏生物技术有限公司提供，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，根据扩增曲线读取循环数(Ct)，将GAPDH作为内参基因，采用相对定量法以2-△△Ct对miRNA-497表达水平进行相对定量分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计量资料比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 A组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等均良好，未出现死亡大鼠；B组大鼠呈现病态特征，精神萎靡呈蜷缩状、活动较少、呼吸浅促、抓起时反抗较轻，毛发枯槁呈黄白色、多见倒竖，进食量明显减少，4只大鼠死亡；C组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长等较B组无明显差异，3只大鼠死亡；D组及E组大鼠精神状态、饮食活动、毛发生长、抓起时反抗等较B组明显好转，各有1只大鼠死亡。

2.2 各组大鼠心肌组织形态学变化 A组大鼠心肌组织排列整齐，横纹清晰，无变性坏死，未见纤维化，间质无充血肿胀，未见炎性细胞浸润；B组大鼠心肌组织排列紊乱，横纹不清，心肌细胞肥大，有大量点状坏死灶，成纤维细胞大量增生，大量胶原纤维取代心肌细胞，纤维化明显，间质明显充血肿胀，炎性细胞浸润明显；C组心肌组织病理改变与B组无明显差异；D组、E组亦出现心肌组织排列略紊乱，横纹不清，存在点状坏死，有成纤维细胞增生，部分胶原细胞取代心肌细胞，有纤维化现象，间质肿胀，也出现炎症细胞浸润。但总体上，病理改变程度较B组明显改善，且D组改善较E组更明显。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态学变化(HE染色，×200)

2.3 各组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率比较 与A组比较，B组、C组、D组、E组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率均明显升高(P<0.05)；D组、E组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率均明显低于B组、C组(P<0.05)，D组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率均明显低于E组(P<0.05)；而C组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率与B组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠AMI面积和心肌细胞凋亡率比较(±s) 单位：%

2.4 各组大鼠心功能指标比较 与A组比较，B组、C组、D组、E组大鼠LVEDP明显升高(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明显降低(P<0.05)；D组、E组大鼠LVEDP明显低于B组、C组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明显高于B组、C组(P<0.05)；D组大鼠LVEDP明显低于E组(P<0.05)，LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax明显高于E组(P<0.05)；C组大鼠LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较(±s)

2.5 各组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量比较 与A组比较，B组、C组、D组、E组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量均明显升高(P<0.05)；C组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量均明显高于B组(P<0.05)；D组、E组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量明显低于C组和B组(P<0.05)；D组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量明显低于E组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中miRNA-497表达量比较(±s)

3 讨 论

对于AMI的发病机制，目前国内外均进行了大量的研究，提示该过程为一个多因素、多环节、多靶点的病理过程，而AMI后心室重构是引起心力衰竭的主要原因，AMI后心室重构是指AMI后左心室进行性扩张和外形改变，其机制涉及氧化应激(oxidative stress，OS)、神经内分泌激素激活、肾素-血管紧张素-醛固酮(renin angiotension aldosterone system，RAAS)系统激活、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、炎性细胞因子等。AMI后心室重构已成为心血管领域的研究热点[7-8]。因此，从病理机制角度探索抑制AMI后心室重构的合理方案具有重要的临床指导意义。

心室重构在中医中无相同病名，但就其心悸、头晕、喘憋、咳嗽、胸闷、胸痛、咯痰、乏力、恶心、腹胀、水肿等心力衰竭症状来说，当属中医“心悸”“喘证”“胸痹”“水肿”等范畴[9]。麝香保心丸是一种中成药，由人工麝香、人工牛黄、蟾酥、冰片、苏合香脂、肉桂、人参提取物组成。麝香保心丸为一种多靶点、多作用途径的治疗药物，具有扩张冠状动脉、改善血流动力学、缓解心绞痛、稳定易损斑块、调节心肌间质胶原表达、缩小梗死心肌面积、抑制血管壁炎性因子、预防心室重构、改善心肌缺血作用。经过多年的临床实践，麝香保心丸已应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)、AMI等心血管疾病的治疗，并且被列为全国中医医院急诊科室首批必备中成药[10-11]。

本研究从动物实验的一般情况及心肌细胞凋亡情况可知，麝香保心丸能够改善AMI后心室重构，这与杨波等[6]的研究结果一致。从传统中医理论的角度，心肌梗死后心室重构多见气虚血瘀，多属本虚标实，这与麝香保心丸的温通胸阳、活血化瘀、益气养心方证相合。

miRNA是近年来分子机制研究领域的热点。长度为20～25个核苷酸，是一类广泛存在于真核生物中的单链非编码小分子RNA。miRNA的作用机制主要是通过靶向结合特定mRNA的3′端非编码区(3′UTR)，促使mRNA降解，抑制mRNA进一步翻译蛋白，从而对靶基因表达进行转录后负调控。前期的研究证实miRNA-497在多种病理过程中表达异常，具有调节细胞增殖、分化、凋亡的作用[12]。miRNA-497可通过负性调节B淋巴细胞瘤/白血病-2(B cell leukemia-2，Bcl-2)而发挥促进缺血性神经元凋亡的作用[13]。在缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)过程中，miRNA-497异常表达[14]。在AMI大鼠心脏中，miRNA-497表达明显上调，如果下调miRNA-497水平，可缩小AMI大鼠心肌梗死面积和减少心肌细胞凋亡，增强自噬(autophagy)流[15]。本研究亦发现下调miRNA表达可抑制细胞凋亡，C组大鼠一般情况、心肌组织病理学改变、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、AMI面积、心肌细胞凋亡率较B组无明显改善，D组及E组大鼠一般情况、心肌组织病理学改变、LVEDP、LV+dp/dtmax、LVESP、LV-dp/dtmax、AMI面积、心肌细胞凋亡率较B组有明显改善，且D组较E组改善更明显，提示miRNA-497是麝香保心丸改善AMI后心室重构中的关键分子，miRNA-497能够介导麝香保心丸改善大鼠AMI后心室重构。

综上所述，miRNA-497是麝香保心丸改善AMI后心室重构中的关键分子，这为AMI后心室重构提供了新的研究方向。