p300/CBP相关因子对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

徐昌武，邱立强，夏 豪，江 洪

心脑血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，严重威胁人类生命健康[1]。动脉粥样硬化是冠心病和脑卒中等多种心脑血管疾病的病理基础，而血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖在动脉粥样硬化和血管狭窄中起着决定性的作用[2]。p300/CBP相关因子(PCAF)是一种转录辅激活子，具有组蛋白乙酰基转移酶活性，最新研究显示PCAF在肿瘤发生、增殖和侵袭、细胞周期调控、凋亡以及基因转录、DNA损伤后修复等细胞生命过程中发挥着重要作用[3-5]。但其在VSMCs中是否具有类似促进细胞增殖的作用却鲜有报道。为此，本研究通过构建病毒以下调PCAF的表达，观察其对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖的作用以及对相关信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SD雄性大鼠(120～150 g)购自湖北省实验动物研究中心。DMEM/F12培养基及1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)，成分包括137 mmol/L氯化钠、2.7 nmol/L氯化钾和10 mmol/L PBS，pH 7.3～7.5，均购自美国HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司；Ad-GFP、Ad-PCAF RNAi(含GFP)重组腺病毒购自上海吉凯基因有限公司；CCK-8细胞毒性及增殖检测试剂盒(CCK-8)购自日本株式会社同仁化学研究所；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、VSMCs表型标志蛋白(α-SM-actin)抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购自碧云天生物技术研究所；丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)一抗均购自美国CST公司；羊抗兔荧光二抗购自美国LI-COR 公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国merck-millipore公司；脱脂奶粉购自武汉谷歌生物科技有限公司；Trizol购自南京AIDLAB公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离培养和鉴定 参照文献[6]，采用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs，用大鼠α-SM-actin抗体进行免疫荧光染色鉴定VSMCs。结果显示，α-SM-actin阳性显色率达到95%以上。第3代～第5代细胞用于后续实验。

1.2.2 病毒转染 将VSMCs以2×105个/孔种植于六孔板中，待细胞生长覆盖至孔底壁约60%左右时，弃去培养液，然后用PBS清洗细胞3次，按照感染复数(MOI)为50加入病毒，进行转染细胞4 h，然后弃去含有病毒的培养液，并加入含10%FBS的培养液继续培养细胞。

1.2.3 实验分组 对照组(A组)、对照组+1 μg/mL 脂多糖(LPS)刺激组(B组)、Ad-GFP腺病毒转染组(C组)、Ad-GFP腺病毒转染+1 μg/mL脂多糖刺激组(D组)、Ad-PCAF RNAi腺病毒转染组(E组)、Ad-PCAF RNAi腺病毒转染+1 μg/mL 脂多糖刺激组(F组)。

1.2.4 CCK-8实验确定脂多糖使用浓度和检测细胞增殖 ①脂多糖使用浓度的确定：将细胞以2.0×104个/孔的密度接种在96孔板中。待细胞融合至60%时，换无血清培养液饥饿处理24 h，再与不同剂量(0 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和50 μg/mL)的脂多糖共同孵育24 h，然后向每孔加入10 μL CCK-8试剂(使CCK-8试剂含量为10%)继续培养2 h后，在酶标仪上(450 nm)测各孔的光密度(OD)值。每组设6个复孔。②细胞增殖检测：将各组细胞按2.0×104个/孔分别接种于96孔板中，待细胞融合至50%～60%，换无血清培养液饥饿处理24 h后，将培养液更换为含1% FBS的培养液或含1% FBS+1 μg/mL脂多糖的培养液继续培养，24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养2 h后，在酶标仪上(450 nm)测各孔的OD值。每组设6个复孔。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 将细胞以2×105个/孔接种于6 cm培养皿中，待细胞融合至60%左右时，饥饿处理24 h。后将各组培养液更换为含1% FBS的培养液或含1% FBS+1 μg/mL 脂多糖的培养液，继续培养24 h。接着用胰酶将细胞消化下来并离心，用PBS洗涤2次后加入预冷的70%乙醇固定细胞并4 ℃过夜。取出细胞离心并用PBS洗涤细胞2次，然后加入0.4 mL 碘化丙啶(PI)稀释液(含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A)室温避光孵育30 min，然后使用流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)检测各组细胞周期分布情况，并计算出各组细胞处于G1期、S期、G2期的比例[7]。

1.2.6 实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测PCAF mRNA表达 采用Trizol提取细胞总RNA。用AMV反转录试剂盒(Promega公司)进行cDNA合成和扩增。相关基因的引物序列见表1。Q-PCR法检测PCAF基因mRNA表达。

表1 Q-PCR检测基因及引物序列

1.2.7 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白表达 蛋白抽提后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白浓度，然后加入上样缓冲液煮沸后备用。按每孔30 μg总蛋白于预先配制好的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行蛋白分离。然后电转至预先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。电转完成后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。PBST(1×PBS含0.1%吐温-20)洗涤3次×5 min后，分别与兔抗大鼠α-SM-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK、AKT、p-AKT、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜。取出PVDF膜用PBST洗涤3次×5 min，再与荧光标记羊抗兔二抗室温孵育1 h。取出PVDF膜，在避光环境下用PBST洗涤3次×5 min后使用Odyssey双色近红外激光成像系统(Li-Cor Biosciences，美国)采集蛋白条带图像，测定灰度值通过校准GAPDH作为内参进行半定量分析。

2 结 果

2.1 大鼠胸主动脉平滑肌细胞及病毒转染效率的鉴定 VSMCs特异性的α-肌动蛋白进行免疫荧光染色结果显示，α-SM-actin阳性显色率达到95%以上(见图1A)。细胞转染病毒24 h后在荧光显微镜下拍得照片，转染效率达90%以上(见图1B)。符合实验要求。

图1 大鼠VSMCs及Ad-PCAF RNAi重组腺病毒转染VSMCs效率的鉴定

2.2 脂多糖最佳使用浓度的确定 当脂多糖使用浓度为1 μg/mL时VSMCs增殖能力明显提高，但随着脂多糖浓度的进一步增加其增殖能力增速减慢，故在本实验中选择脂多糖浓度为1 μg/mL。详见图2。

与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 各组PCAF mRNA表达及VSMCs增殖活性比较 与A组比较，C组PCAF mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；与C组比较，E组PCAF mRNA水平降低约87.8%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明显降低(P<0.05)。与B组比较，D组PCAF mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；与D组比较，F组PCAF mRNA水平明显下降近82.1%(P<0.05)，VSMCs增殖活性明显降低(P<0.05)。另外，B组较A组、D组较C组、F组较E组，PCAF mRNA水平分别增加0.63倍、0.67倍和1.45倍，与此同时，VSMCs增殖活性分别提高11.5%、14.7%和10.5%，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组PCAF mRNA表达及VSMCs增殖活性比较(±s)

2.4 下调PCAF表达对VSMCs细胞周期的影响 与A组比较，C组细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05)；与C组比较，D组细胞经脂多糖刺激后S期(蓝色斜线区域)细胞明显减少，而G2期(黄色区域)细胞占比明显增多(P<0.05)，提示脂多糖刺激后细胞由S期(蓝色斜线区域)进入G2期(黄色区域)，细胞周期进展加快，细胞增殖能力增强。然而与D组比较，F组下调PCAF后，S期(蓝色斜线区域)细胞明显增多，G2期(黄色区域)细胞占比明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，细胞周期S期到G2期阻滞，细胞增殖能力减弱。详见图3。

与C组比较，*P<0.05，△P<0.01；与D组比较，#P<0.05。

2.5 下调PCAF抑制p-p38 MAPK及p-AKT表达 与A组比较，C组p-p38 MAPK及p-AKT表达差异均无统计学意义(P>0.05)；与C组比较，E组细胞中p-p38 MAPK及p-AKT表达明显降低(P<0.05)；与D组比较，F组p-p38 MAPK及p-AKT表达明显降低(P<0.05)；B组较A组、D组较C组、F组较E组，细胞中p-p38 MAPK及p-AKT表达升高(P<0.05)；另外，6组总的p38 MAPK和AKT表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图4。

与D组比较，*P<0.05，△ P<0.01；与E组比较，#P<0.05。图4 Western Blot分析各组蛋白表达情况

3 讨 论

VSMCs的过度增殖在血管成型术后再狭窄及动脉粥样硬化的病理过程中起关键作用。血管损伤时，损伤血管周围内皮细胞及炎性细胞等分泌细胞因子和生长因子等介质，引起损伤部位的VSMCs由静止的“收缩型”向活跃的“合成型”转变，导致VSMCs从中膜向内膜大量增殖和迁移，同时合成细胞外基质参与血管修复，从而形成新生内膜过度增生[8]。因此，有效抑制血管损伤后平滑肌细胞的过度增殖，在抗血管再狭窄和抗动脉粥样硬化治疗中具有重要意义。

PCAF即p300/CBP 相关因子，它是一种转录辅激活因子且具有组蛋白乙酰基转移酶活性，可通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控，与细胞分化、凋亡、肿瘤发生等密切相关[9]。国内外研究发现PCAF在促进肿瘤细胞增殖和迁移中具有重要作用，而关于PCAF在血管增生相关疾病中的研究较少。最新实验研究发现，在小鼠股动脉损伤模型中，PCAF基因敲除的小鼠损伤部位血管内膜增生程度明显较野生型减轻[10]。这与本研究结果相符，本研究通过体外培养VSMCs发现，下调VSMCs内PCAF基因的表达后，VSMCs增殖能力明显降低。因此，PCAF作为一种具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录辅激活因子，在与VSMCs增生相关的疾病如血管再狭窄和动脉粥样硬化的病程中发挥着重要的作用。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和p38 MAPK途径是关键的细胞内信号传导途径，参与多种生理和病理过程，如细胞增殖、细胞周期及炎性反应[11-14]。在多项关于VSMCs增殖的研究中发现，抑制AKT以及p38 MAPK等的磷酸化可以抑制VSMCs增殖[15]。因此，本研究进一步检测了PI3K/AKT和p38 MAPK信号通路的活性，发现下调PCAF的表达后，VSMCs内AKT和p38 MAPK的磷酸化水平也随之降低。这些结果提示，下调PCAF表达所导致的VSMCs增殖能力下降，与抑制AKT和p38 MAPK磷酸化有关。

总之，本研究结果表明，PCAF在VSMCs增殖中具有重要的作用。下调PCAF的表达，可明显抑制VSMCs增殖，而发挥作用的机制至少部分与下调PCAF表达后，VSMCs内AKT及p38 MAPK磷酸化受阻有关。由此推测PCAF可能是较为理想的治疗血管成形术后再狭窄及动脉粥样硬化的一个潜在靶点。