辣木叶多酚提取物对光老化小鼠皮肤的保护作用

孙丽平，李鹏程，庄永亮，孙云

(昆明理工大学 农业与食品学院， 云南 昆明， 650500)

紫外线(ultraviolet，UV)照射是引起皮肤光老化的重要因素。一方面，UV照射产生活性氧(reactive oxygen speccies，ROS)，启动级联反应，从而提升皮肤中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的分泌；另一方面， UV照射加速了促炎症细胞因子的产生，刺激MMPs的产生[1-2]。MMPs含量的增加加速了皮肤中胶原蛋白基质的降解[3]，易引发皮肤的光老化。目前，抑制皮肤光老化的途径主要集中在紫外线屏蔽、紫外线吸收和各种抗氧化剂和抗炎因子等。

辣木(MoringaoleiferaLam.)是辣木科辣木属植物[4]。研究发现，辣木叶中多酚类物质含量丰富，具有较好的生物活性[5-9]。

先前我们对云南产辣木叶多酚提取物(Moringaoleiferaleaves extracts，MLE)进行了提取和体外活性研究[10]。研究发现，MLE中多酚类物质的含量为20.16 mg/g干重， 其中39种化合物被分离鉴定；同时，MLE显示了较好的体外抗氧化、抑菌和抗炎作用。根据MLE的体外生物活性，本文进一步研究MLE对光老化小鼠皮肤的影响。通过分析MLE对光老化皮肤主要组成、氧化应激、MMPs及形态结构的影响，评价MLE对光老化小鼠中皮肤的潜在保护作用，旨在为辣木叶多酚生理活性的深入挖掘及产品应用开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无毛小鼠(雄性，BALB/c，体重20～22 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；辣木叶，由云南天佑科技开发有限公司提供；蛋白质(protein，Prot)浓度、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量等测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；透明质酸(hyaluronic acid，HA)含量、MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-9)含量等测定ELISA试剂盒，购于R&D公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-20B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；SpectraMax Ms多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；Olympus DP70光学电子显微镜，日本Olympus公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辣木叶多酚提取物的制备

准确称取20 g辣木叶样品，加入100 mL提取混合液[V(丙酮)∶V(水)∶V(乙酸)=70∶29.7∶0.3]，混匀，超声波处理5 min，静置20 min，再超声5 min，5 000 r/min离心15 min，取上清液，重复以上步骤2次，混合提取的上清液，45 ℃旋蒸浓缩，冷冻干燥，所得样品(MLE)储存于干燥器中备用。

1.3.2 动物分组及处理

无毛小鼠30只，动物饲养按照标准认证的饮食和水处理，所有小鼠适应新环境1周。将实验小鼠分为3组，每组有10只，包括：正常对照组(normal control group，NC)，无UV照射，灌胃生理盐水；模型对照组(model control group，MC)，UV照射，灌胃生理盐水；MLE组，UV照射，灌胃MLE提取物，样品剂量为150 mg/(kg·d)。

1.3.3 UV照射

动物实验前，测定UVA和UVB照射小鼠皮肤的最小红斑剂量(minimal erythema dose，MED)，确定了UVA和UVB的MED分别为127.84和18.36 mJ/cm。实验小鼠进行UV照射，每周3次，共10周。第1周的照射强度为0.5 MED，每周增加0.5 MED，最高达到4 MED，以4 MED照射小鼠3周。

1.3.4 皮肤的定量指标分析

对皮肤中HYP含量、HA含量、蛋白质浓度，SOD活性，GSH-Px活性，CAT活性，GSH含量、MDA含量及MMPs含量进行测定，测定方法严格按照相关试剂盒的要求。

1.3.5 皮肤的形态结构分析

将小鼠背部皮肤标本(约1 cm×1 cm)在中性缓冲福尔马林溶液(40 g/L)中固定24 h。利用苏木素-伊红(H&E)染色和Van Gieson(VG)染色对小鼠皮肤的一般组织形态和胶原结构进行分析。

1.4 数据统计与分析

实验设定10个平行，数据表示为平均值±标准偏差；使用SPSS 17.0进行数据处理，以最小显著差异法进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 皮肤中HYP和HA含量

长期暴露在紫外线照射下会导致皮肤成分发生变化。胶原蛋白和HA是皮肤中的2种重要成分，在皮肤功能中起着关键作用。胶原降解和损伤是光老化的主要特征。抑制胶原蛋白的产生和促进胶原蛋白的降解是UV照射破坏皮肤胶原蛋白基质的2个主要途径[11]。HYP是胶原蛋白中的一种特殊氨基酸，因此HYP含量经常被用作衡量皮肤胶原蛋白含量的指标[12]。如图1-A所示，UV照射可极显著降低皮肤中HYP含量(P<0.01)，相对于NC组，MC组小鼠皮肤的HYP含量下降了51.21%。摄入MLE后，小鼠皮肤中HYP含量显著增加(P<0.05)，说明MLE可以有效地增加皮肤中胶原蛋白的含量。HA的基本结构是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的大分子，不含硫多糖。HA具有良好的结合水能力，对皮肤的水分维持和弹性保持有重要作用；同时，HA能够支撑皮肤的扩张结构，有助于营养物质和代谢物在皮肤中的扩散[13]。如图1-B所示，UV照射导致皮肤中HA含量显著下降(P<0.01)，表明光老化皮肤的表皮层存在损伤。摄入MLE后，小鼠皮肤中HA含量显著增加(P<0.05)。相对于MC组，MLE组小鼠皮肤的HA提高了39.16%，该结果显示，光老化小鼠的表皮层得到一定程度的修复。

2.2 皮肤中抗氧化酶的活性

氧化应激是UV诱导皮肤光老化过程中的关键因素。UV照射导致皮肤损伤常常来自于活性氧的产生[14-17]。皮肤中存在抗氧化防御系统，包括酶(例如SOD、CAT和GSH-Px)和非酶小分子(例如GSH)。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢；CAT是存在于细胞的过氧化物体内，能够催化过氧化氢分解成氧和水；GSH-Px可以促进过氧化氢与GSH反应生成H2O和氧化型谷胱甘肽。小鼠皮肤中抗氧化酶活性的变化如图2所示。与NC组相比，UV照射使皮肤中SOD和GSH-Px的活性极显著降低(P<0.01)，CAT活性显著降低(P<0.05)。结果表明，UV照射降低了皮肤中SOD、CAT和GSH-Px的活性，从而降低了ROS的清除能力，增加了皮肤的氧化应激。与MC组相比，MLE组的小鼠皮肤中SOD活性极显著增加(P<0.01)，CAT和GSH-Px活性显著增加(P<0.05)。这些结果表明，MLE可抑制UV照射导致的SOD、CAT和GSH-Px活性的下降，从而有效地提升皮肤抑制ROS所产生氧化应激的能力。

A-HYP含量；B-HA含量图1 MLE对小鼠皮肤中HYP和HA含量的影响Fig.1 Effects of MLE on contents of HYP and HA in mice skin注： *表示组间差异显著(P<0.05)；**表示组间差异极显著(P<0.01)(下同)

2.3 皮肤中GSH和MDA含量

GSH是皮肤中具有抗氧化能力的非酶小分子物质，GSH浓度的提高可以有效地缓冲皮肤的抗氧化能力。小鼠皮肤中GSH含量的变化如图3-A所示，与NC组相比，UV照射极显著地降低了GSH含量(P<0.01)，MC组小鼠皮肤中GSH含量为NC组的57.32%。与MC组相比，MLE组的小鼠皮肤中GSH含量显著增加(P<0.05)。

MDA是脂质过氧化过程的典型产物，因此，MDA经常被用来评估脂质过氧化的程度[18]。小鼠皮肤中MDA含量的变化如图3-B所示，与NC组相比，UV照射极显著地提高了MDA含量(P<0.01)，MC组小鼠皮肤中MDA含量为NC组的2.42倍。MLE可以降低MDA含量，相对于MC组，MLE组小鼠皮肤的MDA下降了42.24%。我们先前的研究表明，MLE富含有多酚类物质，具有较好的体外抗氧化能力，可抑制自由基的形成[10]。因此，MLE对光老化皮肤抗氧化体系的保护原因可归结为MLE的多酚组成及其较高的抗氧化能力。

2.4 皮肤中MMPs含量

MMPs是一类结构相关的锌依赖性内肽酶。根据结构和底物特异性差异可分为不同的亚组[19]。MMP-1、MMP-3和MMP-9分别属于胶原酶、间质溶解素和明胶酶。研究表明，MMPs是导致皮肤胶原降解的主要分解酶，MMPs水平可有效反映皮肤中胶原蛋白的损伤程度。MMPs的表达可由UV照射产生的氧化应激和促炎细胞因子产生[20]。小鼠皮肤中MMPs含量的变化如图4所示。UV照射诱发皮肤中MMPs的含量极显著增加(P<0.01)，与NC组相比，MC组小鼠皮肤中MMP-1，MMP-3和MMP-9的含量分别增加了87.55%，65.31%和274.57%。与MC组相比，MLE对光老化小鼠皮肤中MMP-1的含量有极显著的降低作用(P<0.01)，对MMP-3和MMP-9的含量有显著的降低作用(P<0.05)。这些结果表明，摄入MLE后，皮肤中的MMPs的水平显著降低，从而有效地保护了皮肤中的胶原蛋白。结合先前的研究[10]，MLE的体外抗氧化活性和抗炎作用介入对光老化皮肤MMPs含量的抑制作用。

A-GSH含量；B-MDA含量图3 MLE对小鼠皮肤GSH和MDA含量的影响Fig.3 Effects of MLE on the contents of GSH and MDA in mice skin

A-MMP-1含量；B-MMP-3含量；C-MMP-9含量图4 MLE对小鼠皮肤中MMPs含量的影响Fig.4 Effects of MLE on MMPs contents in mice skin

2.5 皮肤的组织形态和胶原结构

表皮层和真皮层是皮肤的2个主要部分[21]。表皮层是机体高效的物理屏障，保护皮肤免受环境影响的关键组织；胶原蛋白是真皮层的主要组成部分。形态组织学分析表明，表皮厚度和胶原结构变化是UV诱导皮肤光老化的主要特征。UV照射可以通过激活表皮生长因子受体以诱导角质形成细胞增殖，表现为表皮增生；同时，表皮增生可以保护皮肤抵制UV照射，这可作为皮肤对UV照射的适应性反应[22]。H&E染色可表达小鼠皮肤的一般形态结构。如图5-A所示，在H&E染色图中，NC组小鼠中表皮结构完整，真皮层纤维组织呈波浪状且分布均匀，方向与表皮平行。与NC组相比，MC组小鼠的光老化皮肤存在表皮层厚度增加伴有角化过度、真皮层组织稀疏、皮脂腺不规则增生等现象。与MC组相比，MLE一定程度上修复了光老化小鼠皮肤的形态结构，真皮层中的纤维更加组织和致密，皮脂腺增生有效改善。结果表明，经UV照射后，小鼠皮肤的表皮层显著增厚。经MLE干预后，光老化皮肤的表皮增厚得到有效的恢复。

UV照射可导致真皮层组织稀疏、纤维分布不均、胶原纤维被破坏等。VG染色可以看出皮肤中胶原蛋白的结构变化。如图5-B所示，在VG染色图中，NC组小鼠皮肤胶原排列致密有序、分布均匀、呈波浪状。与NC组相比，MC组小鼠皮肤胶原纤维排列松弛无序，存在一定的胶原蛋白断裂沉积现象。与MC组相比，MLE组小鼠皮肤胶原纤维分布均匀、出现波浪形状、排列呈现一定的有序化。这些结果表明，MLE可有效的修复因UV照射导致的真皮层组织破碎、胶原纤维稀疏等，从而改善了胶原蛋白纤维基质在皮肤的存在状态。这一结果与皮肤中HYP含量上升(图1-A)和MMPs含量下降(图4)的变化相一致。因此，MLE可明显地降低和修复UV照射引起的外在表皮层和内在真皮层的光老化损伤，这与MLE中多酚物质具有的抗氧化、抗炎和抑制MMPs产生等生物活性相关。

A-H&E染色；B-VG染色图5 小鼠皮肤的组织形态和胶原结构染色Fig.5 Tissue morphology and collagen structure staining of the mouse skin

3 结论

本文建立了UV照射小鼠皮肤光老化模型，评价MLE对光老化皮肤的保护作用。MLE可以有效地增加光老化皮肤的胶原蛋白和透明质酸含量，提升抗氧化系统的活力、抑制MMPs含量的增加，修复皮肤表层和保护胶原蛋白的结构稳定。MLE对UV照射引起的皮肤光老化具有明显的保护作用，其作用机制与MLE较好的体外抗氧化和抗炎活性相关。因此，MLE具有抑制皮肤光老化的潜在作用，在食品营养和医学美容等领域具有一定应用前景。