γ-聚谷氨酸的研究进展

何宇 吕卫光 张娟琴

摘要 γ-聚谷氨酸是一种绿色环保型高分子聚合材料，具有良好的吸附性、保水性和生物相容性，可以被生物体完全降解，作为生物絮凝剂、肥料增效剂、保湿剂、药物载体、食品添加剂等应用于农业生产、医药、化妆品、环保和食品等众多领域，引起了国内外学者的广泛关注。对γ-聚谷氨酸的结构性质、制备方法、提取和应用方面进行综述，重点论述了微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸和γ-聚谷氨酸的应用;最后，基于γ-聚谷氨酸的研究进展和应用，对γ-聚谷氨酸制备中现存问题和未来发展方向进行展望。

关键词 γ-聚谷氨酸;微生物发酵法;结构性质;制备方法;提取;应用

中图分类号 TQ317  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）18-0018-05

Abstract γpolyglutamic acid is a kind of environmental friendly polymer material，which has good adsorption，water retention and biocompatibility，and can be completely degraded by organisms.As bioflocculant，fertilizer synergist，humectant，drug carrier and food additive，γpolyglutamic acid has been widely used in many fields such as agricultural production，medicine，cosmetics，environmental protection and food.The structural properties，preparation methods，extraction and application of γpolyglutamic acid were reviewed，and the application of γpolyglutamic acid produced by microbial fermentation and γpolyglutamic acid was mainly discussed.Finally，based on the research progress and application of γpolyglutamic acid，the existing problems and future development direction in the preparation of γpolyglutamic acid were prospected.

Key words γpolyglutamic acid;Microbial fermentation method;Structural properties;Preparation methods;Extraction;Application

聚谷氨酸（polyglutamic acid，PGA）由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过酰胺键聚合而成。由于聚合方式不同，聚谷氨酸主要有2种构型：通过α-酰胺键聚合的α-聚谷氨酸（α-PGA）和通过γ-酰胺键聚合的γ-聚谷氨酸（γ-PGA），分子量在10～10 000 kDa。其中，α-PGA多以化学途径合成，而γ-PGA多以生物途径合成。

γ-PGA，也称多聚谷氨酸，是一种阴离子型多肽聚合物。γ-聚谷氨酸最早在1937年由Ivanovic等[1]在炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的荚膜中发现，属芽孢杆菌荚膜的主要成分[1];1942年，Bovarnick从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的发酵液中提取到γ-PGA;之后，Nagai等[2]又在納豆杆菌（Bacillus natto）中发现γ-PGA的存在。γ-PGA具有高分子量、易分散和无毒无害可食用等优良特性，是一种新型绿色高分子材料，被广泛应用于农业生产、食品、医药等众多领域。因此，笔者对γ-PGA的基本特性、生产制备及应用等方面进行综述，以期为γ-PGA的进一步工业化应用提供借鉴。

1 γ-PGA的结构与性质

γ-PGA是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成的多聚氨基酸，大多由500～5 000个谷氨酸单体组成[3]。γ-PGA相对分子量会随着处理方式和发酵环境的不同而不同，如随着发酵环境的酸化和温度的升高，生成的γ-PGA分子量会逐渐下降[4]。另外，在不同pH发酵环境中，γ-PGA分子表现出不同的构型，例如在酸性环境下γ-PGA呈螺旋状结构，在中性环境下γ-PGA呈树枝状链结构，在碱性环境下γ-PGA呈舒展状结构[5]。游离型γ-PGA的酸度系数（pKa）为2.23，熔点为223.5 ℃，玻璃化温度为54.82 ℃，热分解温度为235.9 ℃，γ-PGA钠盐的旋光度为-70°[6]。由于有大量游离亲水性羧基和氢键的存在，使得γ-PGA具有极强的保水性、抗逆性和超强的离子吸附性。通过观察X射线衍射谱图，发现了γ-PGA分子中羧基的空间位阻和分子间氢键的双重作用会导致分子链无法保证规整，阻碍γ-PGA结晶，表现出无定形态。另外，在生物分解作用影响下，γ-PGA中的肽键会发生断裂，使γ-PGA直链分子被降解为单体、小分子或是短肽[7]，因此γ-PGA还具有极好的可生物降解性。

2 γ-PGA的制备方法

随着研究的不断深入，化学合成法、提取法、酶转化法和微生物发酵法等生产技术被广泛地应用于γ-PGA的制备。在制备γ-PGA的过程中，微生物发酵法是γ-PGA生产和研究的热点和重点。

2.1 化学合成法

化学合成法包括二聚体缩聚法和传统多肽合成法。二聚体缩聚法制备γ-PGA分为3个部分，首先由D-谷氨酸和L-谷氨酸反应生成α-甲基谷氨酸，之后由α-甲基谷氨酸經凝聚反应生成聚谷氨酸甲基酯，最后经过碱性水解得到γ-PGA[8]。γ-PGA属于多肽聚合物，因此可使用多肽合成法将氨基酸逐个连接形成多肽。多肽合成法较为传统，合成需要进行基团保护、活化、氧化偶联和羧基脱保护等过程，合成工艺繁琐、成本高、得率低，且伴有大量副产物的产出，尤其不适用于制备20个氨基酸以上的大分子物质[9]。

2.2 提取法

纳豆是一种通过枯草芽孢杆菌发酵而成的豆制食物，具有一定的黏性，其纳豆黏性胶体的主要组成成分就是γ-PGA。提取γ-PGA时，首先将纳豆煮熟，然后浸泡在去离子水中，待γ-PGA完全溶于水中，再将水中的γ-PGA用有机溶剂提取出来。因此，早期获取γ-PGA大多是在发酵食物纳豆中利用有机溶剂进行提取。提取法虽然简便易操作，但利用该方法所分离出的γ-PGA为粗产品[10]，杂质多、成本较高且难以大规模进行生产，应用价值较低。

2.3 酶转化法

酶转化法可以有效地克服多肽合成法和提取法的缺点。酶转换法利用一步酶促反应，将谷氨酸单体连接成γ-PGA高分子，高效避免了复杂反应中的反馈和负反馈调节作用，积累得到高浓度的γ-PGA[11]。在这个过程中，谷氨酸转肽酶（GTP）作为关键性酶[12]，将谷氨酸基催化后移至受体，然后进行自动转肽。该方法反应温和、产物杂质少、纯度高，有利于后续的γ-PGA分离纯化。但使用酶转化法得到的γ-PGA聚合度低且分子量小，而γ-PGA分子量的大小直接关系到γ-PGA的物理性质、化学性质及应用[13]，因此该方法的应用价值同样有待提高。

2.4 微生物发酵法

目前，微生物发酵法是工业生产中普遍采用的最佳γ-PGA制备方法，通过菌种筛选、菌体培养和分离纯化制得分子量适宜的γ-PGA。该方法条件温和、工艺简单，可进行大规模生产。发酵法可分为液体发酵法、固体发酵法和分批发酵法等，发酵过程中主要使用的合成菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）等芽孢杆菌属。

工业上生产γ-PGA多使用液体发酵法，使用液体发酵法易于通过调控发酵过程中的可控因素进而调节产物分子量，最终得到目标分子量产物，有效提高工业产率[14]，可控因素包括pH、环境温度、培养基离子强度、接种量等。赵晓行[9]以解淀粉芽孢杆菌YP-2为对象，选择不同初始发酵pH和发酵温度，结果表明初始pH在7.0～7.5时具有最高γ-PGA产量（25.24 g/L），发酵温度在37 ℃时达到最高产量（38.39 g/L）。

固体发酵法因使用固体发酵物（如农业、工业产生的废弃物）作为发酵底物而得名，例如牛粪堆肥、味精和食醋生产产生的残留废物都已被研究应用制备γ-PGA，通过该方法既可获得目标产物，又提高了资源利用率。张彦丽[15]培养枯草芽孢杆菌168产γ-PGA，通过响应面法优化发酵工艺，50 mL味精废水接种量为10.55 mL，γ-PGA产量达到（53.51±0.92）g/L。韩文静等[16]利用味精副产品发酵产γ-PGA，通过产酸率高低调控最优发酵条件，pH为7.0，发酵温度32 ℃，γ-PGA产量最高达到57.8 g/L，实现副产物再利用并降低了生产成本。

另外，分批发酵法也被广泛使用于γ-PGA制备，通过分批式加入部分培养基营养成分，同时也分批次取出发酵液并进行分离提纯γ-PGA，有效避免γ-PGA蓄积导致的底物负反馈抑制效应，提高产率。目前，对于微生物发酵法产γ-PGA的研究集中致力于筛选具有优良性状的菌株，之后将外源基因整合入γ-PGA菌株基因组中，以此提高γ-PGA产量[17]。

3 γ-PGA的生物合成

3.1 γ-PGA生产菌株

γ-PGA的生产菌种根据是否需要在发酵过程中大量添加谷氨酸单体被分为谷氨酸依赖型（Ⅰ型）和非谷氨酸依赖型（Ⅱ型）两大类[18]。非谷氨酸依赖型菌株的产量相比谷氨酸依赖型菌株要低得多，因此我国主要针对谷氨酸依赖型菌株产γ-PGA进行研究。现已鉴定出的γ-PGA生产菌株包括芽孢杆菌、梭杆菌、古细菌及真核生物[19]。其中，在芽孢杆菌的荚膜中，γ-PGA属主要成分，且菌体本身具有合成γ-PGA的效应机制，因此芽孢杆菌较其他生产菌株具有天然优势，是目前制备γ-PGA最常用的菌株。可制备γ-PGA的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）、地衣芽孢杆菌（B.an mLoliquefaciens）、耐热芽孢杆菌（B.thermotolerant）和解淀粉芽孢杆菌（B.an mLoliquefaciens）[20]。

3.2 产γ-PGA菌株选育

由于天然存在的产γ-PGA菌种产量较低，因此需要对高产菌株进行定向筛选，多通过诱变法或基因工程法等方法，以此达到稳定高产的效果。诱变法主要借助物理因子和化学诱变剂完成，物理因子包括紫外线、γ射线、激光等，化学诱变剂包括亚硝基胍、硫酸二乙酯、秋水仙素等，经过处理后的某些菌株会由于基因的片段缺失或转移导致基因突变，从而强化或减弱生物的某种特性，达到对特定目标菌株选育的目的。张瑞等[21]通过紫外线-亚硝基胍复合诱变法选育出一株产γ-PGA突变菌株，在多次传代后可保持稳定遗传，γ-PGA产量由18.4 g/L提高至24.2 g/L。

此外，有学者利用基因工程手段将γ-PGA基因片段导入其他菌株中，使目标菌株具有合成γ-PGA相关基因簇，基因重组得到产γ-PGA的菌株。发生基因重组后的菌种生命力会更强，抗逆性也会相应增强，产γ-PGA的周期大大缩短，具有多种优势，但由于基因供体菌和受体菌的合成机能存在差异，可能导致基因不能正常表达[22]，因此利用该方法发酵生产γ-PGA的产量极其不稳定，不能大规模应用于生产中。

3.3 γ-PGA合成途径

γ-PGA合成机制一直是研究的热点，分子生物学和代谢工程学等理论都被应用在γ-PGA生物合成的研究中。合成菌株不同，對谷氨酸底物的需求也不同，γ-PGA的代谢机制和合成酶也有所差异。Bacillus subtilis IFO 3335菌株是典型的谷氨酸依赖型菌株，仅需少量外源谷氨酸作为合成活化剂，而培养基中的柠檬酸和硫酸铵经过菌株自身代谢才是合成γ-PGA所需单体谷氨酸的主要来源。

Goto等[23]研究发现Bacillus subtilis IFO 3335菌株通过α-酮戊二酸的2种途径合成L型谷氨酸，再通过γ-PGA合成酶合成γ-PGA，在这一过程中，谷氨酸单体是菌株经自身代谢而生成的。另外，在Bacillus subtilis IFO 3335菌株中检查到高活性谷氨酸消旋酶，是γ-PGA合成过程中的主要酶[24]。Cromwick等[25]通过核磁共振技术研究Bacillus licheniformis ATCC 9945A菌株产γ-PGA途径，利用13C标记谷氨酸和柠檬酸，发现在培养基中产生极少量的γ-PGA，而在培养基中添加外源L-谷氨酸和13C标记的柠檬酸后，培养基中产生大量标记γ-PGA，这表明在Bacillus licheniformis ATCC 9945A菌株产γ-PGA过程中的谷氨酸单体并不是通过碳源分解和三羧酸循环等环节产生的。

γ-PGA的合成酶基因根据γ-PGA合成后的状态进行命名。当合成的γ-PGA与细菌细胞壁结合形成荚膜，该γ-PGA合成酶基因命名为cap（capsule）基因，当合成的γ-PGA释放到胞外，该γ-PGA合成酶基因命名为pgs（polyglutamate synthase）基因[26]。在Bacillus subtilis IFO 3336中存在3个γ-PGA合成酶基因（pgsA、pgsB和pgsC），其中，pgsA将pgsBCA同源复合体定于细胞膜上，pgsB为酰胺连接酶，参与催化和聚合反应，pgsC与乙酰转移酶结构相似，参与γ-PGA的转运[27]。

4 γ-PGA的提取

随着研究的深入，γ-PGA的提取方法越来越多，例如膜分离沉淀法、有机溶剂沉淀法、化学沉淀法、分级沉淀法和硅藻土沉淀法等，而前3种提取技术相对成熟。

由于γ-PGA分子量最高可达200万kDa，因此在制备过程中随着γ-PGA的积累，培养液黏度变大，影响发酵效果和产量。针对这种情况，Do等[28]使用膜分离沉淀法，既可从高黏度培养液中有效提取γ-PGA，又大大节省试剂的使用。首先通过沉淀从培养液中分离出粗γ-PGA，之后使用超滤浓缩方法利用中空纤维膜获得浓缩液，在这个过程中将培养液pH逐渐调至3并酸化，以此达到降低培养液黏度的目的。酸化处理后的γ-PGA能量消耗降低17%，乙醇的用量降低75%。

有机溶剂沉淀法通常先将发酵液进行离心处理，在上清液中加入低级醇类，例如甲醇、乙醇，加入体积一般为发酵液的2～4倍，过夜沉淀后离心收集沉淀物，最后进行沉淀物冷冻干燥获得γ-PGA粗产品，之后进行透析脱盐去除杂质获得纯品[29]。

化学沉淀法与有机溶剂沉淀法的区别在于将上清液中加入的低级醇类用氯化钠溶液或饱和硫酸铜代替，沉淀物水洗后加入HCl溶液二次沉淀，之后加入蒸馏水溶解γ-PGA，溶解后上清液中加HS，最后进行沉淀和沉淀物冷冻干燥获得γ-PGA。

5 γ-PGA的应用

γ-PGA作为一种新型的多功能生物制品，具有无毒无害、可食用、易降解和保水性等特性，在农业生产、医药和食品等多个领域都有较强的应用空间。γ-PGA的性质与其分子量密切相关，因此不同分子量γ-PGA的应用领域不同，根据γ-PGA不同应用领域所需分子量的大小，可将γ-PGA分为4个类别，即农业类、食品类、化妆品类和医药类，其中前两类所需分子量较低，均小于70万单位，农业类可低至0.5～1.0万单位，后两类所需分子量相对较高，均大于70万单位，例如医药类需要PGA分子量达120～200万单位[30]。

5.1 γ-PGA在农业领域的应用

5.1.1 保水保湿剂。

在我国西北地区，水资源稀缺导致不同程度的干旱灾害出现，也使得植被和作物生长受限，影响我国的农业发展。保水剂对干旱地区植被具有很好的生长效益，是一种具有极强吸水力和保水力的高分子聚合物，可减少土壤中水分的蒸发，同时缓慢释放水分供植物生长利用[31]。利用电子射线对γ-PGA进行数秒照射后，可以形成一种具有高吸水性能的树脂，从而吸收大量水分。日本学者在水资源匮乏的阿苏山利用γ-PGA进行生态绿化试验，他们使用γ-PGA吸水树脂进行种子包埋试验，将包埋种子撒于寸草不生的沙地，结果表明经过处理的种子在7 d后发芽并顺利生长[32]。

5.1.2 促进种子萌发。种子萌发过程中，脂质过氧化会大大降低种子活力，影响萌发状态，只有消除活性氧引起的过氧化损害，提高过氧化物酶的活性，才能保证种子正常萌发。在不同分子量大小的γ-PGA中置入绿豆种子，记录种子的发芽势和发芽率，结果表明，高分子量γ-PGA抑制种子萌发，低分子量γ-PGA促进种子萌发，但二者的结果均比空白对照组数值高[33]。王建平等[34]用不同浓度γ-PGA溶液进行浸种处理，发现烟草种子的芽长、发芽系数和活力指数等都有明显的提高，其中发芽系数最高提升28%，活力指数较对照提高18.8%，同时种子发芽后过氧化物酶活性增幅达到67.32%，说明γ-PGA浸种能够提高种子萌发活力。

5.1.3 肥料增效剂。

γ-聚谷氨酸作为肥料增效剂被广泛地应用于农业生产中。目前的研究形式多为无机肥料与γ-PGA混合使用，而直接施用γ-PGA菌肥以改善土壤环境，也可取得肥料增效效果。王进[35]将枯草芽孢杆菌发酵产物直接作为菌肥施用，试验结果表明，添加菌肥与不添加菌肥相比，植株生长明显，产量高30.4%，株高和茎粗也明显优于后者，既促进了植物生长又达到了肥料减量的效果。γ-PGA显著提高植物对氮、磷和钾的吸收，增强植物对养分的吸收[36]。Bai等[37]研究发现PGA施用量对作物增产及肥料利用率提高亦有显著影响。

5.2 γ-PGA在医药领域的应用

5.2.1 药物载体。

γ-PGA主链上含有大量活性较高的游離羧基，可同某些分子结合形成稳定化合物[33]。γ-PGA属于典型的聚电解质，与其他聚电解质相比，γ-PGA具有良好的生物降解性，可自行降解为单体，具有无毒副作用。许多天然药物具有难溶性和不稳定性，使生物对药物的利用率大大降低。因此，研究人员利用γ-PGA及其衍生物的高活性羧基与药物或其中有效成分的结合，解决天然药物难溶于水或不稳定的问题[38]，尤其是对人体细胞有伤害作用的化疗药物，既提高药效活性，同时也减轻药物毒副作用。

5.2.2 组织工程支架。

γ-PGA良好的生物相容性被应用于组织工程支架的制备。疏秀林等[39]采用接枝共聚法将γ-PGA与壳聚糖制备成γ-PGA/CMCS多孔复合材料，该材料吸水性强，有较高的携药能力，将其与碳酸钙骨水泥进行复合，可有效缩短碳酸钙骨水泥的凝固时间，促进骨骼的生长和愈合，是一种新型植骨生物材料[40]。

5.3 γ-PGA在环保领域的应用

在污水处理过程中，常常使用絮凝沉淀法以达到高效的污水处理效果。絮凝剂种类繁多，其品质直接影响着处理效果。γ-PGA属线型同聚酰胺高分子，具有优良的黏结性、吸水性和吸附架桥作用，在水污染处理中可作为环境友好型絮凝剂使用，具有广阔的应用前景[41]。李曼[42]筛选获得菌株Bacillus sp.DLF-15161发酵生产絮凝剂γ-PGA，通过优化试验得到最佳γ-PGA用量和最佳絮凝介质高岭土，可对水体中Cr6+、Cu2+吸附，并达到国家水质排放标准。Bajaj等[43]对γ-PGA絮凝活性进行研究，优化了Bacillus subtilis R23发酵生产的γ-PGA的絮凝条件、最佳絮凝pH和最佳助凝离子，结果显示最终的絮凝活性最大可达34.7l/OD。

染料行业排放的废水中含有大量有毒有害成分，其中还包括具有强致癌性的原料副产物，若未进行有效的脱色净化处理，会对水资源和人类身体造成严重危害。娄春霞[20]从污泥中筛选出γ-PGA菌株，通过响应面法得到最优培养基，最佳絮凝时间为3 min，最优条件下絮凝率达94.7%，对染料废液的净化脱色率达64.5%，实现了废水絮凝和脱色同步进行。对废水中染料的处理包括物理方法、化学方法和生物脱色方法，利用γ-PGA对亚甲基蓝染料进行生物脱色处理，饱和吸附容量为496 mg/g[44]。

5.4 γ-PGA在化妆品领域的应用

γ-PGA良好的保水性和吸水性同样运用在化妆品制造业中，目前已有化妆品将γ-PGA作为原料加以使用，不仅具有美白功效，而且还可保持肌肤水分，加速组织再生。低分子量γ-PGA可被皮肤吸收并达到深度保湿效果，高分子量γ-PGA可在皮肤表面形成膜结构，有利于保护皮肤水分，具有锁水保湿效果[45]。何贵东[46]通过有机-无机杂化技术制备具有良好生物相容性的纳米Ag/γ-PGA水凝胶，在Balb/c小鼠动物皮肤上做去除创伤模型，结果发现，该水凝胶具有长效的抑菌效果，炎症反应有明显的好转，在使用水凝胶后14 d可完全恢复。陈毓曦等[47]对不同相对湿度和不同浓度γ-PGA保湿性进行测定分析，表征结果显示γ-PGA在1.0 g/L浓度下具有最佳保湿效果，且保湿效果基本不受环境湿度的影响，验证了γ-PGA作为化妆品保湿剂的功效。在纳豆中，纳豆黏性胶体的主要组成成分就是γ-PGA，日本已将γ-PGA列入促进化妆品及保健品吸收的成分表中。

5.5 γ-PGA在食品领域的应用

在食用领域，高分子量的γ-PGA可对食物分子进行包埋，进而掩盖食物的苦涩味。与高分子量的γ-PGA相比，低分子量γ-PGA更具有低温保护活性[48]。低分子量的γ-PGA可抑制冰晶生长，减少食物中可冻结水量，避免食物结构被冰晶破坏，从而增加冷冻面食的储藏性。γ-PGA中羧基基团在与淀粉发生交联作用后可达到抑制淀粉吸水膨胀的效果，也可使淀粉微观结构更加致密，改善淀粉的流变学性质[49]。将γ-PGA作为食品添加剂添加到酸奶中，随着γ-PGA浓度的不断增加，γ-PGA分子所占体积不断增大，吸附水分子增多，酸奶体系的黏稠度数也随之上升[50]。

6 结语

γ-PGA良好的吸附性、保水性和生物可降解性使其应用范围日益广泛，研究也日益深入。目前，国外对于γ-PGA在医药和环保领域的应用研究颇多，尤其是可作为药物载体对药物起到缓释的价值，而我国对γ-PGA的研究注重于生产菌株的选育和发酵条件的优化，且大多研究都处于实验室阶段，距离实现产业化应用还有一定的距离。在高产菌株的选育过程中，多使用诱变方法，而有研究表明采用基因工程和代谢工程更有力于菌株的筛选，因此在未来的研究中可利用上述2种工程对菌株筛选方法进行优化，以达到高效定向筛选的目的。γ-PGA的相对分子质量直接影响到其理化性质及应用范围，但对影响机制的研究还处于初级阶段，未来利用分子生物学等理论解释该影响机制可作为γ-PGA研究的重点方向之一。同时，还需建立工艺简单、发酵条件温和且成本低廉的生产工艺，扩大γ-PGA的应用范围，为γ-PGA的进一步发展奠定基础。

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